Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Фрайфелдер Д. -> "Физическая биохимия " -> 144

Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.

Фрайфелдер Д. Физическая биохимия — М.: Мир, 1980. — 580 c.
Скачать (прямая ссылка): fizicheskayabiohimiya1980.djvu
Предыдущая << 1 .. 138 139 140 141 142 143 < 144 > 145 146 147 148 149 150 .. 218 >> Следующая

а — 0,01 М фосфатный буфер + 0,001 М. EDTA; 6 — 0,15 М NaCl + 0,015 М цитрат Na.
1,4
1.3
1,2
и
1,0
ДНК фага Т7 50 мкг/мл
0,01 М фосфатный (зуфср, pH 7,8
? 55 60 65 70 75 80
Температура, °С
РИС. 14-15.
Кривые плавления раствора ДНК, полученные путем измерения Z>26о в зависимости от температуры (сплошная линия) или путем нагревания ДНК до определенной температуры (ниже 77,5°С), охлаждения до 25°С и последующего измерения D (та же линия). Температура, при которой происходит разделение цепей, находится в месте пересечения штриховой линии с осью абсцисс.
гуанин — цитозин (рис. 14-14). Следовательно, пара оснований гуанин — цитозин связана, по-видимому, более прочно водородными связями, чем пара аденин — тимин. Во-вторых, если температура возрастает (но не до величины, соответствующей максимальному поглощению) и затем понижается до температуры, ниже которой D не изменяется, тогда D немедленно падает до своей первоначальной величины. Это указывает на то, что при неполном разделении цепей нативная структура легко восстанавливается (рис. 14-15). При наличии межцепочечной ковалентной связи (что является особым случаем) поглощение всегда падает до своей обычной величины. В-третьих, разделения цепей не происходит, пока не будет полностью пройдена область перехода (например, 77,5°С, рис. 14-15), что можно не заметить, по-
Плавление Ренатурация 0,01 MNaCI
Температура, *С
РИС. 14-16.
Обнаружение ренатурация ДНК фага Т7 путем измерения D^.
Вначале ДНК была денатурирована в 0,01 М NaCI. При доведении концентрации NaCI до 0,5 М и понижении температуры до 20°С (/) беспорядочно образуются водородные связи и величина D2eо падает. Когда температура повышается до 76°С (2), случайно возникшие пары оснований разрушаются и D возрастает. Начинается образование правильных пар оснований. Поскольку температура ниже той, которая необходима для разделения цепей, D понижается. Однако ДНК частично денатурирована при этой температуре. Когда температура понижается до 20°С (3), все водородные связи восстанавливаются и ренатурация считается завершенной.
скольку разделение нескольких последних пар оснований вносит совсем незначительный вклад в общее изменение поглощения. В-четвертых, если нагреть ДНК выше температуры, при которой происходит разделение цепей, и затем охладить, возрастание поглощения в условиях высокой ионной силы (0,1) при последующем нагревании уменьшается от 37% (т. е. максимальной величины) до 12%, так как новые водородные связи (внутри- и меж-цепочечные) формируются беспорядочным образом. Следовательно, при высокой ионной силе денатурированная ДНК агрегирует. Если ионная сила низка (0,01), то сохраняется максимальная величина D, потому что из-за отталкивания фосфатных групп цепи остаются разделенными. В-пятых, если ДНК, для которой наблюдается увеличение D на 12%, выдержать в интервале ионной силы от 0,5 до 1,0 и при более высокой температуре, чем Тпл, отвечающая половине перехода (рис. 14-16), то через несколько часов D примет свою первоначальную величину; при этом концентрация ДНК должна быть высокой. Этот процесс называется ренатурацией и представляет собой возвращение к нативной двухцепочечной структуре (см. гл. 1 и 18).
pH
РИС. 14-17.
Кривые титрования тирозина, при построении которых использовали 8295. Гипотетический белок содержит 5 тирозиновых остатков.
А ~ все пять остатков находятся на поверхности. Б — два остатка на поверхности, а три — внутри, в неполярном окружении, и, следовательно, не титруются. В — три внутренних остатка находятся в полярном окружении и доступны растворителю.
Пример 14-Д. Спектрофотометрическое титрование белков. При многих исследованиях структуры белков возникает необходимость определения величины рК диссоциации протонов ионизуемых боковых групп аминокислот, поскольку эти величины указывают на локализацию аминокислоты в белке (правило 2 в табл. 14-2). Это часто можно сделать спектрофотометрически, так как при диссоциации зачастую меняется спектр одного из хромофоров (например, в случае тирозина); см. рис. 14-7. Рассмотрим гипотетический тирозинсодержащий белок и для определения числа внешних тирозиновых остатков воспользуемся правилом 2 (табл. 14-2). Предположим, что в этом белке имеется пять тирозиновых остатков. Если все они расположены на поверхности и ионизуются при увеличении pH, спектр, отвечающий остаткам тирозина, будет приближаться к спектру свободного тирозина при высоких значениях pH, изображенному на рис. 14-7 (правило -26). Другими словами, зависимость ?^5 (^ макс для ионизованной формы) от pH будет выглядеть, как кривая А на рис. 14-17. Когда же, наоборот, три тирозиновых остатка расположены внутри в неполярном окружении, полученная кривая аналогична кривой Б (правило 2а) \ отношение величины первого плато к конечной величине равно ~2/s. Отметим, что при очень высоких pH на кривой видно большое возрастание ?>295- Это указывает на то, что внутренние тирозиновые остатки стали доступны растворителю, т. е. белок развернулся (денатурировал).
Предыдущая << 1 .. 138 139 140 141 142 143 < 144 > 145 146 147 148 149 150 .. 218 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed