Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
В предыдущем примере величина Д1>292, которую можно было ожидать, если бы все триптофановые остатки находились на поверхности, была рассчитана из величин оптической плотности и молярного коэффициента погашения чистого белка в отсутствие пертурбанта. Такой расчет невозможен, если в образце белка содержатся поглощающие примеси. Однако измерение можно сделать другим путем, воспользовавшись тем, что, если белок денатурировал, все аминокислоты находятся в контакте с растворителем. Следовательно, максимальное значение AD292 можно определить из дифференциального спектра денатурированного белка в растворителе-пертурбаите против нативного белка в полярном растворителе.
До сих пор мы пытались отличить внешние аминокислоты от внутренних. Однако это различие не всегда отчетливо, поскольку в некоторых случаях хромофор не спрятан полностью, а находится в глубокой полости. При этом воздействовать на его спектр можно только в том случае, если молекулы пертурбанта меньше некоторого критического размера и могут попасть в по-
РИС. 14-19.
Изучение перехода спираль-клубок в гипотетическом белке методом пертурбационной дифференциальной спектроскопии в 20%-ном водном растворе этиленгликоля, содержащем NaCl в двух различных концентрациях.
Измерения ведутся при одной длине волны. Раствором сравнения для получения дифференциального спектра служит раствор белка в этиленгликоле, содержащем NaCl, при 20°С. Отметим, что этот белок более устойчив при ббльшнх концентрациях NaCl, так как в 0,1 М NaCl он разворачивается при более высоких температурах.
30 40 50 60
Температура, °С
лость. Этот факт также можно использовать для получения информации о конформации молекулы. Приведем список веществ, которые наиболее часто применяют с этой целью, а также их усредненные диаметры: D20 (2,2 А), диметилсульфоксид
(4,0 А), этиленгликоль (4,3 А), глицерин (5,2 А), арабит (6,4 А), глюкоза (7,2 А) и сахароза (9,4 А).
Пример 14-Ж. Переход спираль — клубок в белках (денатурация). Так как в процессе денатурации спрятанный хромофор становится доступным растворителю, контролируя поглощение этих хромофоров, можно наблюдать переход спираль — клубок в белках так же, как путем исследования гиперхромии изучали денатурацию ДНК. Например, если в белке содержатся трип-тофановые остатки, часть из которых расположена внутри, то, измеряя Ае292, можно проследить, как в зависимости от температуры происходит разворачивание молекулы. Это можно, кроме того, использовать для изучения влияния на термическую устойчивость других факторов, таких, например, как концентрация NaCl. На рис. 14-19 показаны такого рода данные, полученные для гипотетического белка.
Пример 14-3. Обнаружение связывания с белками малых молекул. Связывание субстрата с активным центром фермента оказывает влияние на полярность этого района или на доступность его растворителю и часто вызывает изменение спектров хромофоров, находящихся в активном центре или недалеко от него. Сравнивая наблюдаемые изменения с изменениями, происходящими при пертурбации растворителем, можно получить информацию о структуре активного центра. Например, добавление различных субстратов к лизоциму приводит к сдвигу А,Макс триптофана в область больших длин волн. Величина изменения такая, какую можно было ожидать при перемещении одного трип-тофанового остатка из полярного окружения в неполярное. На основании этого можно предположить, что триптофан находится в месте связывания. Кроме того, изучение лизоцима мето-
дом пертурбации растворителем, как в примере 14-Е, показывает, что на поверхности белка находятся 4 триптофановых остатка (т. е. пертурбации может подвергаться некоторая часть из известного числа триптофановых остатков); если изучить фермент-субстратный комплекс, то выясняется, что только три триптофановых остатка находятся на поверхности. Следовательно, когда добавлен субстрат, один триптофан теряет контакт с растворителем. Это можно снова интерпретировать как доказательство присутствия триптофана в активном центре. Значение этого несложного оптического анализа состоит в том, что он осуществляется в растворе и, следовательно, подтверждает, что структура, определенная с помощью рентгеноструктурного анализа (на сухих образцах), а именно наличие в молекуле полости, в которой находится триптофан и происходит связывание субстрата, вероятно, сохраняется для лизоцима и в растворе.
Во многих случаях поглощение хромофоров фермента, субстрата или их обоих меняется в процессе комплексообразования. Следовательно, спектральный анализ (имеется в виду изучение Ае как функции концентрации субстрата или фермента) можно использовать для определения констант диссоциации. Это действительно очень полезный метод, применимый к исследованию связывания с белком любых веществ (например, небольших молекул или ионов металлов) во всех случаях, когда наблюдаются изменения в спектре.
Пример 14-И. Ассоциация белка. Изменения спектров в процессе ассоциации белка могут быть вызваны следующими причинами: либо хромофоры, находившиеся на поверхности, попали в участок связывания и стали недоступны растворителю, либо произошла конформационная перестройка, в результате которой хромофор стал недоступным или доступным, но в другой части молекулы. Следовательно, как в примере 14-3, по спектральным изменениям можно контролировать наличие взаимодействия молекул белка и посредством этого определять условия, кинетику этого процесса и т. д. (рис. 14-20).
