Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
* Далеко не все переходы происходят с высокой вероятностью; в реальных системах действуют определенные ограничения, или правила отбора квантовой механики. Эти правила не будут здесь обсуждаться.
Длина волны,нм
10 ю* ю3 10* ю5 to6
I___________I____________I__________[____________I___________I
I 1 1 L ... 1 J
--------Y-----------f-----------------Y-------------Т----
Х-лучи УФ видимые И К микроволновые
Тип 1------------у-------------1---у----1---у----1----1---'
перефЬа электронный колебательный враицательныи яйерный
I—,—----------------------
внутренняя внешняя
оболочка [ оболочка х_____________^________1 ^ )
Способ стандартная инфракрасная яйерный
изучения абсорбционная спектроскопия магнитный
спектроскопия и спектроскопия резонанс комбинационного рассеяния
РИС. 14-3.
Часть электромагнитного спектра, используемая для исследований в области физической биохимии.
тельным уровнем первого возбужденного состояния, лежат в ультрафиолетовой и видимой области спектра. Возможны также низкие по энергии переходы между колебательными урппшшц р пределах одного электронного уровня. Эти переходы происходят в результате поглощения излучения в инфракрасной области. На рис. 14-3 показана часть электромагнитного спектра, представляющая интерес для биохимиков, и обозначены переходы, которые возникают при поглощении излучения в различных диапазонах частот.
Вероятность перехода при одной длине волны характеризуется молярным коэффициентом погашения.* при этой длине волны. Чтобы определить этот параметр, рассмотрим, как он измеряется. Если свет интенсивности /0 проходит через раствор с толщиной слоя d и концентрацией с, интенсивность прошедшего света / подчиняется закону Ламберта — Бера:
/ = /0 • 10 т. е. lg = — zdc или lg -у = efifc, (3)
где е—молярный коэффициент погашения (экстщпсщщ). Результаты измерения выражают либо как п?оценtjipontjcкания
(100X — ), либо, гораздо чаще, как поглощение A (lg^ ). Ко-
гда d= 1 см, А называют ОА или оптической плотностью **. ин-
* Коэффициент погашения ? называют молярным, если концентрация раствора выражена в г-моль/л, а толщина слоя в сантиметрах. — Прим. rtepee„
** В отечественной литературе оптической плотностью называется величина ]gy~ , которая обозначается буквами А или D. Далее мы используем обозначение D. — Прим. перев.
РИС. 14-4.
Положительное и отрицательное отклонение от закона Бера и причины отклонений.
а — спектральный сдвиг, связанный с возрастанием концентрации, часто в результате полимеризации. Отметим, что при длине волны не наблюдается изменения молярного коэффициента погашения при изменении концентрации. Эта длина волны соответствует изобестической точке, б — кривая, показывающая отклонения от закона Бера. При К\ отклонение положительное (/), при — отрицательное (2). В изобестической точке при \2 закон всегда соблюдается (3).
деке К указывает длину волны, при которой проводится измерение. Оптической плотностью удобно пользоваться, так как она равняется еХс. В некоторых случаях, если с велико, г становится функцией су и тогда можно сказать, что закон Бера * нарушается. Это может быть результатом рассеяния света или структурных изменений (например, димеризации, агрегации или химических изменений) при высоких концентрациях (рис. 14-4).
Аппаратура для измерения поглощения в видимом и ультрафиолетовом свете
Измерение поглощения осуществляют с помощью спектрофотометра. (При описании биохимических образцов почти всегда имеются в виду растворы этих образцов.) Несмотря на различия в конструкции, все спектрофотометры состоят из источника света, монохроматора (для выделения определенной длины волны), прозрачной кюветы, куда помещается образец, детектора света и измерительного прибора или самописца для регистрации выходного сигнала детектора (рис. 14-5). Ход работы обычно сле-
* Закон Ламберта — Бера почти всегда называют законом Бера, хотя это не совсем правильно (имеется другой закон Бера).
8
РИС. 14-5.
Схематическое устройство спектрофотометра.
Свет от лампы 1 проходит через монохроматор 2 для выделения пучка света с определенной длиной волны. Образец 3 и растворитель 4 содержатся в двух кюветах, помещенных в держатель кювет 5. Свет проходит через кювету и падает на фотоэлемент 6, выходной сигнал которого регистрируется измерительным прибором 7. Держатель кюветы находится на направляющих 5, так что каждая кювета может быть независимо помещена в пучок лучей.
дующий: измеряют при одной длине волны интенсивность света, прошедшего через растворитель (который может быть буфером), затем следует измерение интенсивности света, прошедшего через раствор изучаемого вещества в том же растворителе. Далее фиксируется изменение в интенсивности света, по которому можно судить о поглощении растворенного вещества. На практике прибор настраивают таким образом, чтобы он показывал нулевое поглощение при измерении одного растворителя (это называется настройкой прибора на нуль). Осуществив такую настройку, можно снимать показания, соответствующие непосредственно поглощению образца. Для получения спектра эта операция повторяется при многих длинах волн. Некоторые приборы, называемые автоматическими двухлучевыми регистрирующими спектрофотометрами, позволяют осуществлять развертку длин волн и одновременно измерять поглощение образца и растворителя (которые находятся в различных кюветах) и фиксировать с помощью электронного оборудования суммированный поток излучений. При этом на самописце вычерчивается спектр. Эти приборы очень дорогие, но они оправдывают себя при проведении большого количества спектральных анализов.
