Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Если бы три внутренних тирозиновых остатка были в полярном окружении, то получили бы кривую, похожую на кривую В, которая указывает, что эти три остатка имеют значение р/С, отличное от такового для экспонированных групп (правило 2в).
Пример 14-Е. Определение некоторых особенностей конформации белков методом пертурбации растворителем и дифференциальной (разностной) спектроскопии. Согласно правилу 1 табл. 14-2, спектры поглощения хромофоров зависят от полярности их окружения. Это можно использовать для определения: 1) расположения хромофоров внутри или снаружи белка и 2) полярности окружения какой-нибудь внутренней аминокислоты.
Остановимся на п. 2, так как в этом случае легче следовать ходу рассуждений. Некоторый белок помещают в полярный растворитель и получают спектр поглощения внутреннего хромофора. Его сравнивают с известными спектрами того же хромофора в полярном и неполярном растворителях. Если полученный спектр сходен со спектром хромофора в неполярном растворителе, то хромофор должен находиться в неполярной области белка, и наоборот; степень смещения ЯМакс позволяет оценить степень полярности.
Метод пертурбации растворителем позволяет определить в результате регистрации спектров поглощения белка в полярном и неполярном растворителях, является ли аминокислота внутренней или внешней. Поскольку обычно представляет интерес определение структуры белка в водных солевых растворах (моделирующих нахождение белка в живой клетке), необходимо, чтобы неполярный растворитель сам по себе не вызывал конформаци-онных изменений, и это нужно всегда проверять другими методами. В действительности белки очень редко изучают в неполярных растворителях, так как большинство белков либо не растворяется, либо денатурирует в этих растворителях. В обычной практике используют растворитель, который на 80% состоит из воды, а на 20%—из вещества пониженной полярности. Некоторые стандартные смеси приведены в табл. 14-3. Эти растворители с пониженной полярностью называются растворителями-пертур-бантами.
Наиболее удобным приемом, позволяющим применять метод пертурбации растворителем, является дифференциальная спектроскопия, потому что в этом случае нет необходимости определять спектр дважды, т. е. в присутствии и в отсутствие пертур-банта. Обычно в абсорбционной спектроскопии спектр получают путем измерения поглощения раствора и вычитания поглощения растворителя (или, как описано выше, путем настройки спектрофотометра на нуль по растворителю). В дифференциальной спектроскопии в двух кюветах для образца содержатся одинако-
ТАБЛИЦА 14.3
Растворители, обычно используемые в методе пертурбации растворителем
Добавляемая жидкость (20 объемов/100 объемов конечного раствора в Я20)
Диметилсульфоксид Этиленгликоль
Дкоксан Глицерин
Этанол
Добавляемое твердое вещество (20 г! 100 г конечного раствора в Н20)
Арабит Полиэтиленгликоль
Эритрит Сахароза
Глюкоза Мочевина
Манн ит
вые растворы, однако один из них содержит пертурбант. Вместо того чтобы измерять спектры обоих растворов, при каждой длине волны вычитается поглощение одного из поглощения другого раствора (конечно, необходимо, чтобы поглощение обоих растворителей было одинаковым при всех используемых длинах волн — именно так и происходит в случае растворителей, приведенных в табл. 14-3).
Дифференциальный спектр, отличный от нуля, будет появляться только в том случае, если на спектр образца оказывает влияние пертурбант. Параметры, получаемые из таких спектров,— Хмакс и Ае при Хмакс. На рис. 14-18 показаны дифференциальные спектры триптофана и тирозина (аминокислот, которые наиболее часто изучаются методом пертурбации растворите* лем) в 20%-ном этиленгликоле.
Ниже следует пример анализа с помощью метода пертурбации растворителем, в котором используется дифференциальная спектроскопия; в качестве хромофора выступает триптофан. Рассмотрим гипотетический белок с пятью триптофановыми остатками. Как видно из рис. 14-18, на дифференциальном спектре
-100 -
\,нм
РИС. 14-18.
Дифференциальные спектры тирозина ()) и триптофана (2) в 20% -ном водном растворе этьленгликоля. Отметим, что на дифференциальных спектрах Ле могут иметь отрицательные значения.
раствора белка в воде относительно раствора белка в 20%-ном этиленгликоле, имеется пик при 292 нм. Количество триптофана в образце может быть определено из D2sо и егво, измеренных в Н20; а из Дв292 для свободного триптофана в воде и в 20%-ном этиленгликоле известна ожидаемая Д/>292 для образца при условии, что призошла пертурбация всех триптофановых остатков. Допустим, что эта величина равняется 1,00. Если же для этого белка измерить AD2g2y то она будет составлять 0,6. Так как пертурбации подвергаются только те остатки, которые расположены на поверхности, то их число 0,6/1,00-5 = 3. Если известна аминокислотная последовательность белка, с помощью простого приема можно идентифицировать отдельные триптофановые остатки, которые находятся на поверхности. При обработке белка различными окислителями, нндольная группа триптофана окисляется и перестает поглощать. Преимущественно будут окисляться только те триптофановые остатки, которые находятся на поверхности; но это необходимо проверять. Это тоже может быть сделано с помощью метода пертурбации растворителем и дифференциальной спектроскопии. Если Д?>292 = 0 после окисления, окисленные триптофановые остатки должны быть на поверхности. Убедившись в этом, можно заново определить последовательность аминокислот в окисленном белке и отметить положение окисленных триптофановых остатков. Следовательно, могут быть идентифицированы отдельные триптофановые остатки, находящиеся на поверхности. Такого рода информация помогает при установлении пространственной структуры молекулы и часто служит отправной точкой для рентгеносгруктурного анализа.
