Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
л
X
о А 10е
ш 3- Юв
к
к
о
Е 2-Ю8
о>
о 10е
ж:
РИС. 14-11.
Концентрация бактерий, определенная путем измерения оптической плотности.
0.2 0,4 0,6 0,8 1,0 1.2 1,4
Оптическая плотность при 650 мм
на рис. 14-11, удается точно определить концентрацию клеток или сухой массы на единицу объема.
Пример 14-Б. Исследование химических реакций. В ходе реакции должно изменяться поглощение одного из реагентов. В качестве примера из энзимологии рассмотрим измерение активности фермента р-галактозидазы. Эта методика широко используется в молекулярной биологии при изучении функционирования лак-тозного оперона. Этот фермент расщепляет о-нитрофенилгалак-тозид (ОНФГ) с образованием о-нитробензола, который можно определить по его поглощению при 420 нм. Так как, по крайней
РИС. 14-12.
Изучение синтеза Р-галактозидазы путем измерения D420 продукта гидролиза о-нитрофенилгалактозида (ОНФГ). Три культуры, Lac~, Lac+ и диплоид, содержащий две копии генов lac, выращивались в глицерин-солевой среде. При t=0 был добавлен стимулятор синтеза Р-галактозидазы. Через различные промежутки времени брали пробы и обрабатывали толуолом для того, чтобы убить клетки и отделить фермент; затем был добавлен ОНФГ. Через тридцать минут была измерена Dm. В результате этого опыта показано, что клетки Lac- не продуцируют фермент, а диплоид продуцирует приблизительно в два раза больше, чем гаплоид.
мере в некотором интервале, скорость реакции пропорциональна концентрации фермента, из наклона кривой зависимости D от времени гидролиза (рис. 14-12) можно определить количество фермента.
Другой пример — ферментативный гидролиз полинуклеотидов. Согласно правилу 3 табл. 14-2, е (свободного основания) >е (основания в полинуклеотиде). Отсюда, если полинуклеотид гидролизуется до мононуклеотидов, то егбо возрастает. Следовательно, если к образцу полинуклеотида добавить нуклеазу и измерить D2бо как функцию времени, Z)26о будет возрастать, и это возрастание указывает на гидролиз. Как и в случае р-галактозидазы, из наклона кривой зависимости Dzw от времени можно определить количество нуклеазы.
Третий пример — определение мощности дозы рентгеновской установки. Если облучить рентгеновскими лучами раствор FeS04 в H2SO4, ион Fe2+ превращается в Fe3+ который можно определить по его поглощению при 305 нм. Из величины ?>305 можно рассчитать общую полученную дозу излучения.
Пример 14-В. Идентификация веществ путем спектральных измерений. Большинство веществ имеют характерные спектры поглощения и могут быть идентифицированы с их помощью. Для этого измеряют полный спектр либо отношение поглощений при различных длинах волн. Например, в первых работах по опре-
в
РИС. 14-13.
Зависимость оптической плотности трех растворов ДНК от температуры.
а —ДНК Я. colt (50% G-C) в 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,8; б —то же в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,8; б —ДНК Pseudomonas aeroginosa (68% G*C) в 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,8. Температура, при которой изменение поглощения составляет 50% от своей максимальной величины, называется температурой плавления Гдд. Отметим, что 7^ возрастает с увеличением ионной силы раствора и содержания G-С-пар.
делению нуклеотидного состава ДНК ее гидролизовали и основания разделяли хроматографически. Затем идентифицировали индивидуальные основания, получая их спектры и отмечая Д,Макс (в нм): 260,5 для аденина; 264,5 для тимина; 246 для гуанина и 267,0 для цитозина. Чтобы избежать получения полного спектра (для этого необходим автоматический регистрирующий спектрофотометр), воспользовались тем, что основания можно различить, измеряя отношение D250ID2&0. Это отношение составляет 2,00; 1,26; 1,63; 0,31 для аденина, тимина, гуанина и цитозина соответственно. После идентификации оснований было определено количество каждого из них; для этого, как в примере 14-А, измеряли оптическую плотность, так как величины е при Ямакс (13,4-103, 7,9-103, 10,7-103 и 6,1-103 соответственно) известны. [Например, если Z>26o аденина была 0,65, молярная концентрация составила бы 0,65/(13,4-103)-4,9-10-5 М.]
Пример 14-Г. Переход спираль — клубок в двухцепочечной ДНК: денатурация и ренатурация. D2во ДНК возрастает, если ДНК нагревается в определенном интервале температур (рис. 14-13). Эта так называемая гиперхромия является критерием денатурации или перехода спираль — клубок и возникает в результате нарушения стэкинга оснований ДНК, при разделении двух полинуклеотидных цепей (см. правило 3 в табл. 14-2). Таким образом, с помощью простого оптического метода удается определить устойчивость ДНК к воздействию температуры, pH, ионной силы, к добавлению малых молекул, варьированию полярных и неполярных растворителей. Как видно из следующих примеров, этот метод явился мощным средством установления некоторых важнейших свойств ДНК. Во-первых, термическая устойчивость ДНК возрастает с увеличением содержания па’р
РИС. 14-14.
График зависимости Гпл от содержания G-С-пар в молекулах различных ДНК. Показаны величины Гпл для двух различных значений ионной силы. Отметим, что наклон кривых одинаков. [Из Marmur J., Doty РJ. Mol. Biol, 5, 109—118 (1962).]
