Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
оболочки
внутренняя мембрана 6,3±0,8
оболочки
грана тилакоида2' 13,0±1,1
Пероксисома 5,5±0,6 7,0±0,4
Аппарат Гольджи 6-9 6,6±1,8 5-9 7_93) 7-93)
') Неопубликованные данные. Фиксация глутаральдегидом-четырехокисью
осмия. -) Обе прижатые мембраны вместе.
") Эквивалент аппарата Гольджи. Включает секреторные везикулы.
или условные (их концентрация наиболее высока в каком-то определенном
клеточном компоненте, но в меньшем количестве они присутствуют и в других
компонентах); примером может служить глюкансинтетаза II, которая
концентрируется в основном в плазматической мембране, но содержится также
в аппарате Гольджи. Ценность маркеров состоит не только в том, что они
позволяют идентифицировать интересующие исследователя клеточные
компоненты, но и в том, что с их помощью можно определить чистоту
препарата, оценив качественно или количественно содержание примесей. Для
количественной оценки определяют удельную активность ферментов-маркеров в
чистых
Мембранные фракции растительных клеток
77
фракциях либо прямыми измерениями, либо путем экстраполяции. Примеры
данных такого рода для фракций, выделенных из этиолированных гипокотилей
сои, приведены в табл. 2.4. Полный список маркеров для компонентов
растительной клетки дан в обзорах [34, 52].
Для идентификации и определения чистоты фракции необходимо провести
анализ с использованием как минимум двух независимых маркеров для данного
компонента (например, в случае плазматической мембраны необходимо
определить активность глюкансинтетазы II и проверить связывание ФВК при
низких pH; используя морфометрию, последний критерий можно перевести на
количественную основу). Кроме того, необходимо
Номер гввсчции
Рис. 2.5. Распределение мембран классов I (плазматическая мембрана), II
(тонопласт) и III (другие мембраны) при электрофорезе в свободном потоке
(зеленые листья шпината) [23]. Исходная фракция представляла собой осадок
микросом, из которого с помощью дифференциального центрифугирования были
удалены митохондрии и хлоропласты. Классификация мембран основана на
измерении их толщины на электронных микрофотографиях. Класс I - толстые
мембраны (7-11 нм), связывающие ФВК при низких pH [31]; класс II -
толстые мембраны (7-II нм), не связывающие ФВК при низких pH; класс III -
тонкие мембраны (5-7 нм), не связывающие ФВК при низких pH; класс IV -
очень толстые мембраны (12-14 нм), состоящие из прижатых мембран
тилакоидных гран.
78
Глава 2
иметь репрезентативные электронные микрофотографии данной фракции и
сводную таблицу удельных активностей каждого из маркеров, указанных в
табл. 2.4 или аналогичных им, которые охватывали бы все основные
клеточные компоненты гомогената. Помимо обычно определяемых активностей
маркеров для митохондрий, эндоплазматического ретикулума, плазматической
мембраны и аппарата Гольджи, нужно оценить активности маркеров для
тонопласта и пластид. Следует также учесть наличие пероксисом, хотя
содержание их невелико (разд. 13). Получе-
Рис. 2.6. Связь между удельной ферментативной активностью и составом
мембранных фракций, выделенных из сои в сахарозном градиенте [23]. А.
Сукнн-нат-INT-редуктаза и митохондрии. Б. NADPH-цитохром с - редуктаза и
шероховатый эндоплазматический ретикулум. Мембранный состав фракций
определен морфометрически.
ние всех указанных оценок часто затрудняется неспецифическим
распределением каталазы в клетках растений. Электронно-микроскопические
данные должны быть представлены в количественном виде; кроме того, сами
фотографии должны быть высокого качества, чтобы можно было установить не
столько чистоту фракции, сколько морфологические характеристики, на
которых основывается идентификация.
Для количественного представления электронно-микроскопических данных
рекомендуется следующий простой метод, описанный впервые в работе [53] и
использованный впоследствии для анализа выделенных фракций [54].
1. Изготавливают прозрачный трафарет, расчерченный параллельными
прямыми, отстоящими друг от друга на 1 см.
Мембранные фракции растительных клеток
79
Таблица 2.4. Ферменты-маркеры для клеточных компонентов из этиолированных
гипокотилей сои
Клеточный компонент Фермент-маркер Удельная активность1) Единицы
Ссылки2)
Эндоплазм ати- NADPH-цитохром 15,3 Мкмоль восстанов- [35, 45]
ческий рети- с - редуктаза ленного цит. с/ч
кулум3) на 1 мг белка
Аппарат Гольд- Латентная ГОРаза 47 мкмоль Р/ч на 1 мг [39, 46]
жи41 (pH 7,2) белка [46, 47]
П чазматиче- Глюкансинтетаза 585 нмоль включенной
ская мембра- II (1 мМ UDPG) [|4С]-глюкозы/ч
на на 1 мг белка
Тонопласт АТРаза, ингибируемая N03- и стимулируемая CI- 0,55
мкмоль/ч на 1 мг белка [21, 48]
Митохи! дрпи5> Сукцинат-INT-pe- дуктаза 37,5 мкмоль
восстановленного INT/ч на 1 мг белка [35, 49]
Этиопласты61 Каротиноиды 80 нг на 1 мг белка [38]
Пероксисомы Каталаза - 40
') Приведены значения для очищенных фракций, полученные расчетным путем с
помощью регрессионного анализа фракций с известным содержанием оргаиелл,
