Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
как Б5+Б6, а также В5+В6-фракции плазматических мембран [14, 99].
7.6. Разделение плазматической мембраны и тонопласта с помощью
электрофореза в свободном потоке
Электрофорез в свободном потоке (рис. 2.4) позволяет получить из одного
гомогената одновременно высокоочищенные фракции и плазматических, и
тонопластных мембран. Фракции, находящиеся вблизи места нанесения образца
(самые дальние от анода), обогащены плазматическими мембранами, а
фракции, наиболее удаленные от места нанесения образца (ближайшие к
аноду), - тонопластными мембранами (рис. 2.5). Остальные клеточные
компоненты (диктиосомы, эндоплазматический ретикулум, пластиды и
митохондрии) располагаются между указанными фракциями. Методика
разделения состоит в следующем [21].
1. Гомогенизируют 35-40 г ткани (например, кусочков ги-покотилей сои),
фильтруют гомогенат через нейлоновую ткань и центрифугируют в течение 10
мин при 6000g.
2. Центрифугируют полученный супернатант в течение 30 мин при 60 ООО g.
3. Суспендируют осадок в буфере для электрофореза (см. ниже),
центрифугируют 30 мин при 60000g и окончательно ресуспендируют осадок в
буфере для электрофореза из расчета около 1 мл буфера на 10 г веса
исходной ткани.
Буфер для электрофореза: 0,25 М сахароза, 2 мМ КС1,
10 мкМ СаС12, 10 мМ триэтаноламин и 10 мМ уксусная кислота, pH доведен до
7,5 с помощью NaOH. Электродный буфер: 100 мМ триэтаноламин и 100 мМ
уксусная кислота, pH доведен до 7,6 с помощью NaOH.
4. Проводят разделение в ячейке для непрерывного электрофореза в
свободном потоке (VaP-5, Bender and Hobein, Munich, FRG или аналогичная
установка) при постоянном напряжении 800 В/9,2 см, силе тока 165±10 мА,
скорости потока буфера 1,7 мл фракции/ч, скорости внесения образца 2,7
мл/ч и температуре 6 °С. За распределением образца следят по поглощению
света с А, = 280 нм.
5. Собирают мембраны из очищенных или объединенных фракций
центрифугированием при 80 000 g в течение 30 мнн.
8. Митохондрии
Функционально активные митохондрии были выделены из многих источников
растительного происхождения [101]. Общие соображения, высказанные в
начале главы, в той же степени
90
Глава 2
применимы и к митохондриям; отдельного обсуждения требует лишь вопрос о
выделении их из зеленых тканей [102]. Для выделения митохондрий из
растительных гомогенатов в среду добавляют БСА, очищенный от жирных
кислот, и агенты, связывающие хиноны, например поливинилпирролидон (ПВП).
Превосходными источниками растительных митохондрий являются клубни
картофеля (Solatium tuberosum), почки цветной капусты (Brassica oleracea
var. italica), соцветия-початки восточной скунсовой капусты
(Stjmplocarpus foetidus), а также клубни топинамбура (Helianthus
tuberosus), хотя на самом деле митохондрии можно быстро получить из любых
растительных тканей, включая корни кукурузы (Zea mays), проростки гороха
(Pisum sativum), листья шпината (Spinacea oleracea), проростки маша
(Phaseolus aureus) и корни свеклы (Beta vulgaris) и рапса (Brassica
napus).
1. Гомогенизируют ткань в двух объемах среды, содержащей 0,3 М маннитол
(или сахарозу), 4 мМ цистеин, 1 мМ ЭДТА, 30 мМ буфер MOPS, pH 7,8, и
0,1%-ный обезжиренный БСА; иногда добавляют также 0,6% (в/о) ПВП.
2. Фильтруют гомогенат (прочная ячеистая ткань, нейлоновая сетка,
Miracloth) и центрифугируют его в течение 3-4 мин при 4000 g, чтобы
освободиться от крахмала и пластид.
3. Для осаждения митохондрий центрифугируют супернатант при 10 000 g.
4. Очищают митохондрии от других мембран, присутствующих в осадке,
центрифугированием в градиенте плотности сахарозы [103, 106].
Ресуспендируют осадок в 4-6 мл среды и наслаивают на непрерывный градиент
сахарозы 33-60% (в/в). Центрифугируют при 100000 g в течение 3 ч (ротор
Beckman SW-28 или аналогичный). Митохондрии концентрируются в растворе с
плотностью 1,19 г/мл, а лизоеомы (глиоксиеомы) - 1,25 г/мл [193]. Кроме
сахарозы, можно использовать перколл [104 ,105, 107-111], декстран [112,
113], фиколл [114] или водную двухфазную систему [115, 116]. Разделение в
градиентах плотности перколла позволяет получать препараты,
характеризующиеся высокой скоростью окисления субстрата и отношением ADP
: Ог, близким к теоретическому значению [117-119].
5. Для оценки чистоты препарата определяют активность ци-тохромоксидазы
[120] или NADH-сукцинатоксидоредуктазы [49].
Описаны методы субфракционирования митохондриальной фракции на наружные и
внутренние мембраны [121], однако маркеры для наружной митохондриальной
мембраны растений отсутствуют. Моноаминооксидаза, использующаяся для этой
цели в случае клеток животных, в растительных клетках не может служить
маркером, поскольку находится в растворимом состоянии [50]. Чтобы
установить локализацию компонентов ды-
Мембранные фракции растительных клеток
91
хательной цепи, используют субмитохондриальные частицы с ориентацией
мембраны, обратной таковой в интактных митохондриях. Их получают
обработкой митохондрий ультразвуком с последующим дифференциальным
