Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
центрифугированием для освобождения от неразрушенных митохондрий [122].
В литературе можно найти данные и о других маркерах (например, о
фумаразе, цитохромах); описаны критерии целостности митохондрий
(дыхательный контроль, окислительное фосфори-лирование) и методы
исследования конфигурации мембран [103].
9. Эндоплазматический ретикулум
Существует несколько методов получения эндоплазматического ретикулума из
различных растительных источников, в том числе из эндосперма клещевины
[123], гипокотилей сои [35, 124] и корней кресс-салата [125, 126].
Эндоплазматический ретикулум из эндосперма клещевины получают следующим
образом.
1. Нарезают лезвием бритвы эндосперм двадцати четырехдневных проростков в
8 мл среды следующего состава: 150 мМ трицин (pH 7,5), 10 мМ КС1, 1 мМ
MgCl2, 1 мМ ЭДТА, 13%-ная (в/в) сахароза.
2. Фильтруют через нейлоновую ткань, доводят объем до 10 мл и
освобождаются от обломков центрифугированием при 270 g в течение 10 мин.
3. Наносят супернатант на непрерывный градиент плотности сахарозы (6-
60%). приготовленный в буфере следующего состава: 150 мМ трицин, 10 мМ
КС1, 1 мМ ЭДТА (pH 7,5).
4. Центрифугируют при 100 000 g в течение 4 ч (в роторе Beckman SW-28 или
аналогичном). Собирают эндоплазматический ретикулум, сконцентрированный в
слое с плотностью 1,12 г/мл (см. таблицы в Приложении). Полученная
фракция загрязнена другими мембранами (разд. 10).
Идентификация эндоплазматического ретикулума основывается в основном на
наличии рибосом, связанных с мембранами; для усиления связывания в среду,
использующуюся для выделения, следует добавить Mg2+ до конечной
концентрации 5- 50 мМ. В число ферментов, используемых в качестве
маркеров, входят NADPH-цитохром с - редуктаза, маннозилтрансфераза [127],
терминальные ферменты биосинтеза фосфолипидов [1283, такие, как CDP-
холинцитидилтрансфераза [123]. Последняя присутствует и в аппарате
Гольджи [7, 129]. Используют также цитохром с-редуктазу, хотя она
содержится и в других клеточных компонентах. При выявлении
маннозилтрансферазной реакции, которая в животных клетках протекает, по-
видимому, исключительно в эндоплазматическом ретикулуме [130], необходимо
92
Глава 2
1,ВМ
Центрифугирование 30 май при 35000 д {
> Липиды
ОтВрасиВают Супернатант >
Заменяют s' супернатант средой Оля гомогенизации, пригона! зеннай на 1М
сахарозе
Суммарный гомогенат ИДеНТИфиЦИрОваТЬ раСТВОрИ-
ФильтраЯание через Miracloth МЫП В СМ6СИ X Л О р О ф О р М / М 6 -
Центрифугирование 30мин при 10000а ГаН0Л Продукт " пРОИоВОД-
t ное полиизопренола. Для
Наслаивают на сахарозную повлатку ЭТОГО ИСПОЛЬЗуЮТ НесКОЛЬКО
тестов, включая хроматографию в ДЭАЭ-целлюлозе (в форме ацетата) и
освобождение и идентификацию ман-нозы при мягком кислотном гидролизе
[127]. Глюкозо-6-фосфатаза в растениях отсутствует, и гидролиз глю-козо-
6-фосфата в растительных гомогенатах осуществляется при помощи
неспецифической растворимой фосфатазы.
Гладкий эндоплазматический ретикулум в растительных клетках встречается
гораздо реже, чем в животных. Тем не менее в клетках растений с
выделяющими масла железами можно обнаружить обширные области трубчатого
эндоплазматнче-ского ретикулума без рибосом [131]. В большинстве же
растительных клеток гладкий эндоплазматический ретикулум присутствует
только в виде локальных сегментов внутри крупных цистерн, к которым
присоединены рибосомы.
Для последующего отделения шероховатого эндоплазматического ретикулума от
митохондрий со сходными размером и плотностью необходимо освободить
эндоплазматический ретикулум от рибосом путем экстракции их с помощью
ЭДТА или концентрированных растворов КС); прн этом уменьшается плотность
мембран. Альтернативный подход состоит в увеличении плотности путем
добавления магния [132],
S.uf-r'jcee*-'.
зсгррзчяъ^
мембрсьы
Центрифугирование 90мин SO-15BODC g
D.5M
¦1,0М
удиктиассмы
}
Зсгразнаюисие
мемсрсны
Рис. 2.9. Простая методика выделения диктиосом аппарата Гольджи с помощью
ступенчатого градиента сахарозы. (Из работы [50].)
Мембранные фракции растительных клеток
93
индуцирующего агрегацию мембран эндоплазматического ретикулума.
Разделение мембран эндоплазматического ретикулума и митохондрий проводят
также с помощью электрофореза в свободном потоке [23].
10. Аппарат Гольджи
Фракции мембран аппарата Гольджи были получены из источников
растительного происхождения путем центрифугирования в непрерывном [133,
134] или ступенчатом [24, 50] градиенте плотности сахарозы, а также с
помощью зонального центрифугирования [26]. Пример простой методики
выделения фракции мембран, обогащенной аппаратом Гольджи, из стеблей сои
представлен на рис. 2.9. В среду для выделения добавляют декстран до
конечной концентрации 1%; выделение необходимо проводить как можно
быстрее, поскольку стопки диктиосом постепенно разрушаются [24].
Идентификация органелл основывается на их характерной морфологии
(перфорированные цистерны) [3] и плотности в градиенте сахарозы (1,12
