Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
в среду для гомогенизации необходимо добавить альбумин или готовить ее на
предварительно отцент-рифугированном кокосовом молоке [3]. Кокосовое
молоко - это жидкий эндосперм кокосовых орехов; его очищают
центрифугированием в течение 1-3 ч при 100 000 g. Полученный супернатант
не содержит мембран, но вместе с ним во фракции попа-
5-1488
66
Глава 2
дают низкомолекулярные белки или посторонние ферменты; тем не менее
кокосовое молоко - недорогой и эффективный источник протоплазмы растений
(рис. 2.2).
Для стабилизации структуры органелл и фиксации их морфологии можно
добавить глутаровый альдегид (конечная концентрация 0,1%, о/о) либо к
свежеприготовленному гомогенату [5, 6], либо на какой-либо стадии
выделения. Препараты, стабилизированные глутаровым альдегидом, не
разрушаются при дальнейшей очистке, однако их применение для определения
ферментативной активности ограниченно. Обычно в таких случаях для анализа
результатов пользуются методом экстраполяции [7]- Химический анализ
подобных препаратов возможен в тех случаях, когда несущественно наличие
сшивок между ами-но-, SH- и гидроксильными группами (а именно - при
определении общего содержания N или Р), а также при исследовании кинетики
включения изотопов in vivo [8, 9].
3. Основные подходы к разделению мембран
Суть выделения растительных мембран из гомогената состоит в
концентрировании фракций органелл или клеточных компонентов. Задача
исследователя заключается в получении фракций с хорошим выходом
компонентов, в достаточном количестве, не загрязненных другими клеточными
компонентами; при этом функциональное состояние мембран должно быть
таким, чтобы возможно было их дальнейшее исследование. Для оптимального
разделения можно основываться либо на каких-то отдельных свойствах, по
которым различаются клеточные компоненты, либо на всех подобных
свойствах. Как правило, это такие характеристики, как форма, размер,
плотность, поверхностный заряд, химические и ферментативные свойства
наружной поверхности мембраны, причем эти различия могут быть как
природными, так и созданными искусственно. По-видимому, для полного
фракционирования растительных клеток необходимо использовать совокупность
методик и основываться на нескольких свойствах мембран.
Далее мы будем следовать рекомендациям, данным де Дю-вом [10]. Он
предлагает называть любую организованную область цитоплазмы, состоящую из
макромолекул разных типов, термином клеточный компонент, а не органелла.
Термин "орга-нелла", приемлемый для компонентов, ограниченных мембраной и
представляющих собой отдельные образования (а именно - митохондрии,
пластиды, ядра, пероксисомы), становится неоднозначным в современном
употреблении. Для крупных протяженных клеточных структур, таких, как
эндоплазматический рети-кулум, плазматическая мембрана, тонопласт и
аппарат Гольд-
Мембранные фракции растительных клеток
67
жи, термин "клеточный компонент", по-видимому, будет более адекватным.
Термин химический компонент обозначает индивидуальный тип молекул (т. е.
липиды, белки, сахара, нуклеиновые кислоты), из которых состоят клеточные
компоненты.
Термин маркер относится к такому химическому компоненту, природному или
внесенному искусственно, который обнаруживается в основном в каком-то
одном клеточном компоненте или его части и сохраняется, когда этот
компонент выделяют и он лишается естественного окружения интактной клетки
[11]. Предложенное де Дювом [12] определение содержит оговорку о том, что
некоторые маркеры свойственны только клеточным компонентам определенных
типов клеток или определенных видов растений или животных.
Далее мы кратно опишем принципы трех основных подходов к фракционированию
растительных клеток. Сведения об их историческом развитии и о
подробностях методик можно найти в работах, ссылки на которые приведены в
описании каждой методики (см. также гл. 1).
3.1. Дифференциальное центрифугирование и центрифугирование в градиенте
плотности
Центрифугирование широко используется для выделения мембран и клеточных
компонентов. Поведение частиц при центрифугировании определяется двумя
основными параметрами: скоростью седиментации (s) и плотностью (р).
Андерсон разработал концепцию s - р-пространства [13], в котором может
происходить разделение органелл по их размеру (скорость седиментации) или
плотности либо и по тому, и по другому параметрам одновременно (рис.
1.2). Органеллы и клеточные компоненты с одинаковыми размерами и
плотностью нельзя разделить с применением только разных способов
центрифугирования. Практически для достижения эффективного разделения
мембранных клеточных компонентов используют три типа центрифугирования.
3.1.1. Дифференциальное центрифугирование
При дифференциальном центрифугировании первыми осаждаются клеточные
компоненты с наибольшей массой (т. е. целые клетки и ядра), а последними
- с наименьшей (т. е. микровезикулы). Получающийся осадок может состоять
из нескольких слоев (когда для выделения более чем одного клеточного
