Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 31

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 25 26 27 28 29 30 < 31 > 32 33 34 35 36 37 .. 191 >> Следующая

крупных частиц путем фильтрования через нейлоновую ткань и
центрифугирования при 4000 g в течение 10 мин. Ферментами-маркерами и
характерными химическими компонентами являются а-маннозидаза для
тонопласта (Тп), NADH-цнтохром с - редук-таза (NADH-цит. с) для гладкого
эндоплазматического ретикулума (гЭР), глюкансинтетаза I (ГС-I) и ЮРаза
(нуклеотиддифосфатаза, субстрат IDP) для аппарата Гольджи (АГ),
глюкансинтетаза II (ГС-П) для плазматической мембраны (ПМ), каротинонды
для пластид (Пл) и цитохромоксидаза (цит. оке.) для митохондрий (М).
Пероксисомы или микротельца (мкТ), по-видн-мому, располагаются справа от
митохондрий. (Из работы [14] с изменениями; оригинальные данные любезно
предостатвлены Dr. G. F. Е. Scherer, Botanical Institute, University of
Bonn, FRG.)
Мембранные фракции растительных клеток
71
ных клеточных компонентов (а возможно, и мембраны одного компонента, но
из разных источников) могут иметь неодинаковый поверхностный заряд.
Сначала подбирают условия распределения, варьируя полимеры и солевой
состав среды. Очень важно тщательно готовить растворы полимеров,
поскольку их свойства могут изменяться от партии к партии. В связи с этим
исходные растворы полимеров проверяют каждый раз после их очистки (см.
также гл. 1).
Процедура разделения состоит в том, что фазовую систему, содержащую
мембраны, перемешивают встряхиванием 20-¦ 40 раз, а затем центрифугируют
непродолжительное время при
Сахарозный градиент; Одычный сахарозный приготовленный на градиент
накосаВом мапаке
МолРрная иониентраиия
0.65 0,8
0,8 1,0
1,0 1.2
',2 1,4
Рис. 2.2. Обычный ступенчатый градиент сахарозы и градиент сахарозы,
приготовленный на кокосовом молоке, использующиеся для разделения
клеточных компонентов гомогената сои. В кокосовом молоке содержатся
растительные белки, которые способствуют стабилизации мембран и
ферментов. По своим осмотическим свойствам кокосовое молоко эквивалентно
0,2 М сахарозе.
4 °С на малой скорости в бакет-роторе с подвесными стаканами, в
результате чего полимеры разделяются на две фазы (рис. 2.3). Мембраны,
сконцентрировавшиеся в разных фазах, либо еще раз подвергают
распределению, либо отмывают для дальнейшей очистки, либо собирают
окончательно.
3.3. Препаративный электрофорез в свободном потоке
Этот метод разработан Хэннигом и др. [19]. Смесь компонентов, подлежащую
разделению, вносят тонкой струйкой в разделяющий буфер, который движется
перпендикулярно наложенному электрическому полю (см. также гл. 1).
Мембраны с
72
Глава 2
W
I
ЧгУ
^ , г
Намер пробирки
Рис. 2.3. Очистка плазматических мембран с помощью распределения в водной
двухфазной системе. Суспензию плазматических (светлые кружки) и других
(темные кружки) мембран вносят в приготовленную смесь растворов
полимеров. чтобы получить фазовую систему нужного состава. Содержимое
пробирок хорошо перемешивают переворачиванием (40 раз) и оставляют
уравновеситься. Разделение двух фаз ускоряют с помощью низкоскоростного
центрифугирования в бакет-роторе с подвесными стаканами. Затем 90%
верхней фа-* зы (Ui) удаляют (до уровня, соответствующего пунктирной
линии) и дважды повторяют перераспределение со свежей нижней фазой (этапы
1 и 2) для дальнейшей очистки; при этом получают фракцию U3. Чтобы
увеличить выход плазматических мембран, можно повторить экстракцию нижних
фаз со свежей нерхней фазой (этапы 1-3) и получить фракцию U3'. Свежие
верхнюю и нижнюю фазы получают из исходных растворов для фазовой системы,
приготовленных отдельно. Подробности см. в разд. 7.2. (Из работы [18].)
Мембранные фракции растительных клеток
73
разным поверхностным зарядом, перемещаясь с буфером, отклоняются от
направления движения буфера в ячейке неодинаковым образом и разделяются
(рис. 2.4). Недавно с помощью этой методики удалось выделить
плазматические мембраны и тоно-пласты непосредственно из гомогената как
этиолированных стеблей [21], так и зеленых листьев [22]. Кроме того, были
раз-
гШвиектар
фракций
Рис. 2.4. Принципиальная схема препаративного непрерывного электрофореза
в свободном потоке. Перерисовано и печатается с разрешения фирмы Bender
and Hobein, Munich (Из работы [20].)
делены митохондрии и эндоплазматический ретикулум [23]. Последнее имеет
большое значение, поскольку митохондрии часто загрязняют фракции
эндоплазматического ретикулума.
4. Идентификация клеточного компонента и критерии его очистки
Идентификация выделенного клеточного компонента (ов) является одной из
важнейших задач при фракционировании. Для ее решения можно использовать
биохимические маркеры или
74
Глава 2
характерные морфологические свойства компонентов. Как правило, желательно
сочетание обоих способов. При идентификации прежде всего важна корреляция
признаков выделенного клеточного компонента и компонента, локализованного
в интактной клетке. Компонент, содержащий латентную кислую фосфатазу,
сначала был выделен из животных клеток, а позднее идентифицирован методом
Предыдущая << 1 .. 25 26 27 28 29 30 < 31 > 32 33 34 35 36 37 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed