Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 30

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 24 25 26 27 28 29 < 30 > 31 32 33 34 35 36 .. 191 >> Следующая

компонента соответствующим образом увеличивают или время, и/или скорость
центрифугирования) либо содержать только один слой (время и скорость
подобраны таким образом, чтобы
5*
68
Глава 2
Таблица 2.1. Режим центрифугирования, использующийся для осаждения
клеточных компонентов растений1)
Клеточный компонент Время, мин f! ¦ мин
Целые клетки 500 5 2500
Ядра 51 0 7 3500
Хлоропласта 2000 2 4000
Митохондрии 6000 15 9)000
Аппарат Гольджи (диктиосомы) 10 000 20 200 000
Плазматическая мембрана - везику- 16 000 20 320 000
лы тонопласта
Пероксисомы 17 500 20 350 000
Везикулы эндоплазматического рети- 17 500 20 350 000
кулума (микросомы)
Окаймленные везикулы (микровези- 20 000 20 400 000
кулы)
]) Приведенные значения приблизительны и относятся к клеточным
компонентам, суспендированным в 0.25 М растворе сахарозы к
центрифугируемым в стандартных пробирках (длина пути по вертикали 9 см).
седиментировал только один компонент). Режим центрифугирования
представляют в виде записи
Центробежное ускорение-время (g'-мин).
В табл. 2.1 даны примерные значения этих параметров, необходимые для
осаждения различных клеточных компонентов.
Разделение мембран путем дифференциального центрифугирования суммарного
гомогената никогда не бывает полным. Так называемые ядерные
митохондриальные и мнкросомные фракции, о которых шла речь в ранних
прописях, представляли собой в лучшем случае грубые смеси. Тем не менее
дифференциальное центрифугирование позволяет получать, с одной стороны,
частично обогащенные фракции, которые впоследствии можно разделить
другими методами, а с другой - конечный продукт при разделении смесей,
приготовленных с помощью других методик, например электрофореза в
свободном потоке. При получении частично обогащенных фракций необходимо
позаботиться о том, чтобы осадок не был слишком плотным. Для этого можно
использовать центрифугирование на сахарозной подложке, или "мини-
градиент" (рис. 2.8).
3.U. Центрифугирование в градиенте плотности
Для создания градиента плотности обычно используют сахарозу, хотя в
некоторых случаях применяют другие вещества - ренографин, фиколл, перколл
и метризамид (см. также гл. 1).
Мембранные фракции растительных клеток
С9
Концентрации их выражают в процентах, молях или единицах плотности (в
последнем случае указывают температуру) (см. Приложение I). В случае
сахарозного градиента наиболее удобной величиной является молярность.
Градиенты могут быть непрерывными (линейными или нелинейными) и
ступенчатыми. Ступенчатый градиент наиболее предпочтителен при
препаративном фракционировании клеток, поскольку его легко готовить и он
обеспечивает воспроизводимое получение мембранных фракций с хорошими
чистотой и выходом. Градиенты, особенно ступенчатый, не нужно
центрифугировать для уравновешивания.
Чтобы ускорить получение препарата и обеспечить максимальную сохранность
структур и функциональной активности, мембранные препараты обычно
центрифугируют не менее 30 мин. На рис. 2.1 показан результат разделения
растительного гомогената в непрерывном градиенте, а на рис. 2.2 -
ступенчатый градиент для препаративных исследований, приготовленный на
основе полученных с помощью непрерывного градиента данных.
Стандартные методики с применением градиента плотности сахарозы (см.,
например, работу [15]) оказываются наиболее полезными при проведении
опытов по идентификации различных мембран, но имеют ограниченную ценность
как препаративные методы из-за перегрузки градиента загрязняющими
препарат мембранами.
3.1.3. Зонально-скоростное центрифугирование
Зонально-скоростное центрифугирование состоит в том, что мембраны
центрифугируют в среде с определенной плотностью или плотностями для
того, чтобы замедлить осаждение какого-то одного клеточного компонента
относительно других и, следовательно, увеличить эффективность
дифференциального центрифугирования. В качестве примера можно рассмотреть
отделение поверхностных мембран от митохондриальных из фракции D в
градиенте, представленном на рис. 2.2. При наслоении этой фракции на 1,25
М раствор сахарозы и центрифугировании в течение 10 мин при 10 ОООg"
митохондрии осаждаются, а поверхностные мембраны остаются в супернатанте.
Последние затем разбавляют буфером в отношении 1:1 и собирают с помощью
дифференциального центрифугирования.
3.2. Распределение в водных двухфазных системах
Эта методика основана на использовании смеси растворов двух полимеров,
которая самопроизвольно разделяется на две фазы. Этот подход был
разработан Албертсоном [16, 17] и использует поверхностные свойства
мембран. Так, мембраны раз-
70
Глава 2
25 30 35 00
Кониентсаиия сахарозы, % (S/S)
Рис. 2.1. Разделение суммарного гомогената этиолированных гипокотилей
тыквы (Cucurbita реро) в непрерывном градиенте плотности сахарозы. Этот
рисунок в полной мере иллюстрирует относительную сложность
фракционирования растительного гомогената. Сначала освобождаются от
Предыдущая << 1 .. 24 25 26 27 28 29 < 30 > 31 32 33 34 35 36 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed