Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
суммарного белка в этом гомогенате равно 52 мг на 10 г сырого веса ткани
(табл. 2.5). Суммарная активность гомогената составляет 52-2,1 = = 109,2
мкмоль восстановленного INT на 10 г сырого веса за 1 ч. Удельная
активность очищенных митохондрий равна 37,5 мкмоль восстановленного INT
на 1 мг белка за 1 ч (табл. 2.4). При содержании белка в митохондриях 2,5
мг на 10 г сырого веса ткани (табл. 2.5) и чистоте фракции 90% получаем
выход 37,5-2,5/0,9=104,2 мкмоль на 10 г сырого веса за 1 ч. Суммарная
активность в гомогенате (109 мкмоль на 10 г сырого веса за 1 ч) и
активность для митохондриальной фракции (104 мкмоль на 10 г сырого веса
за 1 ч) достаточно близки, чтобы данный фермент можно было считать
абсолютным маркером для митохондрий.
Аналогичные расчеты проведены для соевых бобов [50] и печени крысы [56].
6. Морфология и морфометрия
Для полной характеристики любой мембранной фракции* выделенной из клеток,
следует, помимо всего прочего, провести электронно-микроскопические
исследования. Иногда может ока-
6-1488
82
Глава 2
заться полезной и световая микроскопия (например, для контроля за
деструкцией клеток и/или ядер).
Основная задача электронно-микроскопических исследований состоит в
контроле состава фракций путем прямого наблюдения и в количественном
определении состава мембран выделенных фракций. Для этого необходимо
обеспечить хорошую сохранность морфологии структур, чтобы можно было
идентифицировать большинство мембран. Идентификация может быть основана
на характерном внешнем виде клеточного компонента (ядра, диктиосомы,
шероховатый эндоплазматнческий ретику-лум, пероксисомы, митохондрии,
пластиды), толщине мембраны и дифференциальном контрастировании с помощью
ФВК при низких pH (тонопласт, плазматическая мембрана, эндо-
плазматический ретикулум без рибосом) (разд. 4) или цитохимической
локализации какой-либо ферментативной активности (например, латентной
инозиндифосфатазы для аппарата Гольджи).
Чтобы эти количественные характеристики были достоверны, необходимо
обеспечить репрезентативность исследуемого препарата. Если образец
гомогенен, достаточно взять пробу из любого места случайным образом. Если
же осадок имеет слоистую структуру, то необходимо взять несколько проб по
всей толщине осадка вдоль оси центрифугирования.
6.1. Фиксация
При фиксации мембран растительных клеток воспроизводимые результаты дает
обработка глутаровым альдегидом (1 - 2,5%) в фосфатном буфере (0,1 М) при
pH 7,2 в течение часа или более и дальнейшая фиксация 1%-ным раствором
четырех-окиси осмия в течение одного часа или в течение ночи в том же
буфере. Образцы можно хранить в растворе глутарового альдегида как угодно
долго, и в любой момент продолжить процедуру фиксации. При
контрастировании препаратов с помощью ФВК при низких pH лучше проводить
дегидратацию в ацетоне, а не в этаноле, а время выдерживания в растворах
уменьшить до 5 мин. Удовлетворительные результаты дает заключение
материала в эпон [57]. Отметим, однако, что заключение в эпон [58] может
создавать помехи при контрастировании плазматических мембран с помощью
ФВК при низких pH.
6.2. Негативное контрастирование
При морфологическом анализе можно использовать также негативное
контрастирование.
1. Смешивают каплю образца, суспендированного в.дистиллированной воде
или в разбавленном буфере (присутствие боль-
Мембранные фракции растительных клеток
83
ших количеств солей или сахарозы мешают анализу), с каплей 1%-ной ФВК, pH
которой доведен до 7,0 гидроокисью калия. Смешивание проводят
непосредственно на сеточке для электронной микроскопии с углеродным
напылением, покрытой коллодием.
2. После перемешивания удаляют избыток жидкости с помощью пастеровской
пипетки или капилляра либо фильтровальной бумаги.
3. Подсушенный таким образом препарат немедленно просматривают под
электронным микроскопом.
Мембраны растительного происхождения можно стабилизировать, добавив
раствор глутарового альдегида до приготовления препарата для электронной
микроскопии.
Преимущество негативного контрастирования состоит в том" что мы очень
быстро получаем необходимую информацию. Это позволяет контролировать
процесс очистки на решающих этапах; например, можно выяснить, необходима
ли дополнительная очистка при разделении в двухфазной системе для
освобождения от митохондрий. Еще одно преимущество негативного
контрастирования заключается в том, что этот метод позволяет отличить
фрагменты митохондрий от других частиц, содержащих электронтранспортную
цепь. Интактный аппарат Гольджи также обнаруживает при негативном
контрастировании характерную морфологию, отличную от морфологии
плазматической мембраны и тонопласта. Однако различить тонопласт и
плазматическую мембрану этот метод не позволяет.
7. Плазматическая мембрана и тонопласт
Разработка методов выделения тонопластов и плазматических мембран из
одного гомогената открывает новые возможности для изучения динамических
свойств мембран, процессов транспорта, роста растений и других аспектов.
