Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 37

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 31 32 33 34 35 36 < 37 > 38 39 40 41 42 43 .. 191 >> Следующая

запасающие корни.
Растительные вакуоли обладают лизирующими свойствами, что позволяет
считать их функционально эквивалентными ли-зосомам млекопитающих [85];
выделенные препараты вакуолей проверяют на наличие гидролазной
активности. Чистоту фракции оценивают в первую очередь по отсутствию в
ней маркеров других компартментов [34, 80, 81, 84, 86]. Имеются данные о
присутствии в вакуолях из сорго цианогенного гликозида Ларина [79, 87], а
в вакуолях других растений - ингибитора протеи-наз I [83] и малата [82].
Все эти соединения, а также а-манно-зидаза [80, 82, 88, 89] содержатся
внутри вакуолей и теряются при их разрушении. Согласно теоретическим
оценкам, основанным на изменении отношения площади поверхности к объему
при постепенном измельчении вакуоли [90], и в соответствии с результатами
прямых измерений ферментативной активности [91] при гомогенизации вакуоли
ее содержимое на 97% солюбилизируется и лишь 3% остается внутри
выделенных замкнутых везикул.
Поиски маркера для везикул, образующихся из тонопласта, привели к
обнаружению анионстимулируемой, М?2+-зависимой, ингибируемой нитратом
АТРазной активности, предположительно связанной с тонопластом. Впервые
эти данные были получены для везикул из латекса Hevea brasilianensis [92,
93], а затем - для изолированных вакуолей из корнеплодов столовой красной
свеклы [94]. Однако вопрос об абсолютной специфичности этого маркера
остается нерешенным [18]. Мы провели сравнительный анализ высокоочищенных
фракций плазмалеммы и тонопласта, полученных с помощью электрофореза в
свободном потоке (разд. 7) из гомогената этиолированных гипокоти-лей сои;
результаты свидетельствуют о том, что указанная АТРазная активность
действительно связана с тонопластом [21].
Мембранные фракции растительных клеток
87
7.4. Тонопластные везикулы, обладающие транспортной активностью
(замкнутые везикулы)
Замкнутые и проницаемые везикулы эритроцитарных мембран человека можно
отделить друг от друга благодаря различию по плавучей плотности в
градиенте плотности высокомолекулярного полимера [95]. Крупные молекулы,
например декст-ран, не проходят через мембрану замкнутых везикул, поэтому
внутри них создается пониженное осмотическое давление, однако везикулы
при этом не схлопываются. Плотность замкнутых везикул определяется в
основном их содержимым (например, везикулы, замкнутые в среде с
плотностью 1,03 г/мл, будут находиться в равновесии в растворе с
плотностью 1,06 г/мл), а плотность везикул с утечкой - плотностью мембран
(1,10- 1,20 г/мл). Для выделения везикул с транспортной активностью из
обогащенной фракции тонопластных мембран применяют подслаивающий раствор
декстрана с высокой плотностью [96]. Можно использовать также градиенты
плотности ренографина. По-видимому, полученные таким образом везикулы
обладают более высокой удельной транспортной активностью, чем везикулы,
выделенные только с помощью дифференциального центрифугирования или
очищенные в градиенте плотности сахарозы, как это следует из приведенных
выше соображений [97, 98].
7.5. Выделение тонопластной и плазматической мембран с помощью
последовательного центрифугирования в градиентах плотности сахарозы и
глицерола
Для обогащения фракций тонопластных и плазматических мембран, обладающих
способностью к ATP-зависимому транспорту протонов, можно использовать
препаративную методику, включающую два последовательных цикла
центрифугирования: в ступенчатом градиенте плотности сахарозы и
изопикническое центрифугирование в градиенте плотности глицерола [14,
99]. Эта методика применима, например, в случае этиолированных стеблей
растений.
1. Тонко измельчают ткань и растирают ее в ступке пестиком при 0°С в
среде, содержащей 8%-ный этаноламин (в/в), 20 мМ ЭДТА, 0,4 мМ (1-
глицерофосфат натрия (grade III, Sigma). 2 мМ дитиоэритреитол и 0,15 мМ
нуперкаин или тетракаин (агенты, предохраняющие липиды мембран от
быстрого ферментативного расщепления после гомогенизации ткани [100]).
2. Фильтруют гомогенат через нейлоновую ткань и центрифугируют при 4 000g
в течение 10 мин.
3. Наносят супернатант на ступенчатый градиент сахарозы (рис. 2.8) и
центрифугируют 30 мин при 90 000 g.
88
Глава 2
4. Собирают фракции А2 и АЗ, наносят их на градиенты плотности глицерола
(см. п. 5) и вновь центрифугируют. Перед нанесением доводят концентрацию
сахарозы во фракции А2 до 0,15 М, используя 1,2 М раствор сахарозы и
буфер для гомогенизации.
5. Градиенты плотности глицерола готовят в пробирках для бакет-ротора
Beckman SW28.1 (17 мл) или аналогичной ему и центрифугируют в течение 2 ч
при 90 ООО g.
Детальный анализ маркерных активностей показывает, что В1 представляет
собой фракцию тонопластных мембран, тогда
Франция
Рис. 2.8. Последовательное использование градиентов сахарозы и глицерола
для выделения фракций плазматических мембран и тонопласта из стеблей
растений (разд. 7.5). (Из работ [14, 99].)
Мембранные фракции растительных клеток
89
Предыдущая << 1 .. 31 32 33 34 35 36 < 37 > 38 39 40 41 42 43 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed