Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
установленным независимо с помощью морфометрии.
2) В первой из указанных работ описаи способ регистрации, а во второй
приведены даииые об удельной активности. Подробности см. в работе [50].
3) Включая ядериую оболочку.
) В качестве альтернативы можно использовать глюкаисинтетазу I (1.5 мкМ
UDPG) с удельной активностью 0,2 имоль включенной |мС]-глюкозы из UDP-
[14С]-глюкозы в щелочноцерлстворимый глюкан за I ч на i мг белка [46.
47].
5) Наряду с некоторыми другими ферментами можно использовать
цитохромокендазу с удельной активностью 1,13 мкмоль Ог/мин на I мг белка
[50, 51].
6) Можно определять также содержание моногалактозил- и
дигалактозилдиглицери-дов; их содержание превышает I мг на I мг
фосфолипида [381.
2. Анализируют микрофотографии препаратов при увеличении примерно 35 000.
Подсчитывают число пересечений всех мембран с линиями наложенного
трафарета, а затем - число пересечений для мембран отдельных клеточных
компонентов.
3. Представляют результаты в виде числа пересечений мем-
бран конкретного компонента, отнесенного к 100 пересечениям с суммарными
мембранами.
5. Распределение маркеров и их выход
Составление таблиц распределения маркеров и их выхода совершенно
необходимо для того, чтобы установить, насколько обоснованно применение
того или иного маркера, какова их специфичность, а также насколько велика
эффективность выделения. Используя в качестве маркера какой-то
определенный химический компонент или ферментативную активность, во-
первых, измеряют объем исходного гомогената и каждой получен-
80
Глава 2
ной после выделения ресуспендированной фракции и, во-вторых, определяют
содержание белка и активность маркера в аликвотах каждой из фракций. Эти
данные используют для расчета удельной активности, которая используется
впоследствии для определения абсолютного выхода активности. Суммарная
активность в каждой фракции должна примерно соответствовать содержанию
клеточного компонента в суммарном гомогенате. Отклонение ее более чем на
10-20% указывает на ошибку в определении или на возможную активацию или
инактивацию фермента.
Чтобы определить суммарный выход активности, необходимо связать состав
выделенных фракций и интактной клетки.
1. Реконструируют целую клетку по электронным микрофотографиям серединных
срезов определенного числа хорошо зафиксированных клеток. Если
растительные клетки содержат вакуоли, необходимо просмотреть по крайней
мере 10 клеток. Микрофотография только одной, даже случайно выбранной
клетки может дать искаженное представление.
2. Используя метод пересечений [53] (см. выше), оценивают относительное
содержание каждого клеточного компонента:
Чисто пересечений с конкретным компонентом
--------------------------- (% от суммарного количества мембран)
100 пересечений с суммарным мембранным препаратом
3. Связывают эти данные с содержанием белка, приготовив гомогенат, в
котором разрушено более 90% клеток; убеждаются, что выход органелл
достаточен для определения суммарного белка.
4. Центрифугируют гомогенат при 100 000 g в течение 90 мин, чтобы
получить суммарный препарат мембран.
5. Определяют суммарное содержание белка и относят его к исходному сырому
весу ткани. Из этих данных можно получить содержание белка в миллиграммах
на единицу сырого веса ткани для каждого клеточного компонента, как это
показано в сводной табл. 2.5 на примере мембран из этиолированных
гипокотилей сои.
6. Определяют выход активности следующим образом. Оценивают удельную
активность (ед./ед. белка) для данного маркера в суммарном гомогенате и в
очищенной фракции. Сильно обогащенные фракции считают чистыми либо
оценивают степень их очистки, используя какой-либо маркер. Чтобы получить
суммарную активность, надо умножить удельную активность в гомогенате на
содержание в нем белка. Для расчета доли суммарной активности во фракции
какого-либо клеточного компонента умножают удельную активность маркера
для этой
Мембранные фракции растительных клеток
8>
Таблица 2.5. Содержание клеточных компонентов в кортикальной цитоплазме
этиолированного гнпокотиля сои, определенное морфометрически [50]
Клеточный компонент Доля суммарного количества мембран, % Содержанке
белка, мг на 10 г сырого веса
Ядерная оболочка 3,9 0,6
Эндоплазматический ретикулум 30,6 4,5
Аппарат Гольджи 12,3 1,8
Плазматическая мембрана 13,1 1,9
Тонопласт 10,3 1,5
Митохондрии 17,2 2,5
Этиопласты 12,2 1,8
Микротельца 0,2 0,03
Супернатант - 37,4
Суммарный гомогенат 52,0
фракции на количество белка, приходящегося на этот компонент в клетке, и
делят эту величину на степень очистки фракции. Если полученные цифры для
суммарного гомогената и для клеточного компонента совпадают, то данный
фермент можно считать абсолютным маркером для этого клеточного
компонента.
Пример. Удельная активность сукцинат: 2-п-иодофенил-3-п-нитрофенил-5-
фенил-2Н-тетразолийхлорид (сукцинат-INT)- ре-дуктазы в гомогенате из сои
равна 2,1 мкмоль восстановленного INT на 1 мг белка за 1 ч. Содержание
