Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
используют 15%-ный ПЭГ 6000).
- Культуральная среда (например, для P. hybrida используют MSP1 9М,
приложение 2[II]);
агаризованная MSP1 9М. с 0,8% агара (2 мл в чашках Петри диаметром
5 см, X 5) жидкая среда MSP1 9М (100 мл).
3.3.2.3. Методика
Примечание: соблюдайте стерильность. Работайте в ламинарном боксе, за
исключением экстракции клеток для оценки временной экспрессии через 48 ч.
1. Добавляют 20 мклб> суперепирализованнойв> плазмидь* (например,
pCaMVCAT) к протопластам и осторожно перемешивают.
2. Прогревают пробирку (тепловой шок)г> 5 мин на водяной бане при
45 °С. Охлаждают на льду до комнатной температуры (3-4 мин) и затем
оставляют при комнатной температуре на 10 мин.
Трансформация растительных клеток путем трансфекции ДНК 219
Таблица 3.2. Зависимость между импульсом при электропорации
~и выживаемостью протопластов
Напряжение, В/см Длительность импульса, Выживаемость прото
мкс пластов, '%
0 10 90
1000 10 50
2000 10 40---45
3000 10 25---30
3. Добавляют 0,5 мл раствора ПЭГД) и осторожно перемешивают.
Инкубируют при комнатной температуре 10 мин.
4. Для каждого тестируемого параметра^ переносят соответствующий
объемж) протопластов в камеру для электропорации и прикладывают один или
более импульсов. Например, для электропорагора Kriiss используют величину
напряженности поля в диапазоне 500-3000 В/см и длительность импульса 10-
30 мкс.
5. Переносят протопласты в чашку Петри диаметром 5 см, содержащую 2 мл
агаризованной среды для культивирования.
6. Повторяют стадию 4 со следующей аликвотой протопластов и объединяют
порции в одной чашке Петри для достижения. необходимой плотности высева.
7. Инкубируют чашку Петри при комнатной температуре 10 мин, а затем
добавляют3) 10 мл жидкой среды для культивирования.
'8. Оценивают выживаемость аликвоты протопластов (разд. 2.7) с помощью
микроскопа. В табл. 3.2 показана зависимость между выживаемостью
протопластов и напряженностью поля для электропоратора Kriiss в
эксперименте, схематически изображенном на рис. 3.6.
9. Инкубируют протопласты в темноте при 25 °С в течение 36-48 чи>.
10. Осаждают протопласты центрифугированием (400 об/мин).
Ресуспендируют осадки в 1,0 мл жидкой среды для культивирования,
переносят пробирки Эппендорф и очень быстро переосаждают (при низкой
скорости).
1L Определяют активность CAT, как указано в разд. 6.4.2. На рис. 3.6
показаны результаты эксперимента, в котором в протопласты P. hybrida
вводили pCaMVCAT путем электропорации с помощью прибора Kriiss и
описываемой методики. Очевидно, что напряженность 2000 В/см и
длительность импульса 10 мкс обеспечивают оптимальный уровень временной
экспрессии CAT при ограниченных потерях выживаемости протопластов.
220
Глава S
Примечания
a) Во всех опубликованных до сих пор методиках электропорации используют
среду с высокой проводимостью, содержащую ионы либо Mg2+ [38], либо Са2+
[12]. Проводимость препарата протопластов можно довести путем добавления
MgCl2 и измерения сопротивления (используя, например, прибор AVO В183 LCR
meter, Thorn-EMI Ltd.). Сопротивления в диапазоне 1 - 1,2 кОм были
определены как оптимальные [38]. Однако, работая с прибором типа Kriiss
ТА 750, можно использовать и среды с низкой проводимостью, поскольку
кратковременные прямоугольные импульсы напряжения эффективны в таких
средах. Действительно, в экспериментах с протопластами Petunia сорта Blue
Lace более эффективная электропорация была достигнута (в отношении
активности САТУ при использовании нормальной среды для культивирования
этих протопластов (MSPI 9М), у которой сравнительно низкая проводимость.
Часто в среду для электропорации добавляют ДНК-иоситель, чтобы обеспечить
альтернативные субстраты для секретируемых иуклеаз, например ДНК из
тимуса теленка в концентрации 40 мг/мл [38]. Однако следует отметить, что
эта ДНК тоже будет встраиваться в хромосомы обрабог ганных протопластов.
0В
750 В
1500 В
2000 I
3000 В
тт т ф
ш
т т л m9t т
т ^ : т 4" "1 т
Ф • Ф'ф • • Ф
о ? 1 о (c)
Рис. 3.6. Анализ временной экспрессии активности CAT в протопластах
Petunia hybrida сорта Blue Lace через 48 ч после электропорации и
введения pCaMVCAT. Были приложены импульсы 0, 750, 1500, 2000 и 3000 В/см
длительностью 10 мкс.
б) При этом концентрация плазмиды составляет 10 мкг/мл, что считается
удовлетворительным как для стабильной трансформации [38], так
и
для временной экспрессии [12].
*> Как и в случае трансфекции с помощью ПЭГ, частота трансформации, как
правило, повышается, если вектор предварительно был переведен в линейную
форму.
г) Было показано, что тепловой шок (5 мни при 45 °С) перед добавлением
