Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
Раствор ЗХСТАВ-буфера очень вязок, и если его ие добавлять к суспензии
протопластов быстро и не перемешивать тщательно, то> возможно образование
комков вместо лизиса протопластов. Комки протопластов легко заметить,
тогда как полностью лизированный препарат
212
Глава 3
прозрачен. Агрегаты дебриса протопластов будут связывать много ДНК, в
том числе и интериализоваииую векторную плазмиду, и, таким образом, при-
гибридизации ДНК сигнал будет занижен. Это следует учитывать при
рассмотрении результатов. я) На этом этапе ДНК можно хранить в виде
осадка под 100%-иым этанолом и высушить под вакуумом на более поздней
стадии перед анализом с помощью дот-блоттинг-гибридизации. Целостность
векторной ДНК после эндоцитоза можно проверить и с помощью блоттииг-
гибридизации по Саузерну (гл. 5), чтобы убедиться в целостности вектора.
Считается, что поглощение в присутствии ПЭГ происходит очень быстро,
поэтому в среду для инкубации крайне редко включают ингибиторы иуклеаз.
Основные принципы введения метки в ДНК с помощью олигонуклеотид-иой
затравки и проблемы, связанные с гибридизацией ДНК, обсуждаются в разд.
5.5 и 5.6.
**> Необходимо отметить, что следить за количеством и качеством
доставленного внутрь клеток вектора обязательно только при разработке
методики переноса гена посредством ДНК (DMGT). Наиболее важно оценить
выживаемость протопластов, после трансфекции и, разумеется, наблюдать за
экспрессией интериализованиой ДНК. Общая стратегия заключается в
определении условий, которые обеспечивают эффективное поглощение
недеградированной ДНК и высокую выживаемость протопластов, а затем в
анализе временной экспрессии векторной ДНК В популяции протопластов через
несколько дней после обработки ПЭГ. Как только экспрессия маркерных генов
будет оптимизирована, появится потенциальная возможность селекции
отдельных трансформированных колоний.
На этом этапе фильтры можно хранить в сухом темном месте в течение
нескольких недель до проведения гибридизации ДНК.
3.3. Трансформация протопластов с помощью электропорации
-3.3.1. Основные положения
•3.3.1.1. Основные принципы электропорации
В 1982 году Нейман с соавторами [27] .показали, что частота
трансформации клеток мыши экзогенной ДНК значительно увеличивается при
воздействии электрических импульсов. Электропорация, как был назван этот
процесс, вызывает кратковременное образование пор в плазматической
мембране [45], через которые такие макромолекулы, как ДНК, перемещаются
внутрь клетки. По-видимому, диаметр пор достигает не менее .30 нм, и они
существуют в течение нескольких минут после импульса [29]. Напряженность
поля (градиент напряжения) и длительность импульса (или время спада)- это
две основные переменные величины, влияющие на проницаемость клеточных
мембран при электропорации. Показано [27], что напряженность поля,
необходимая для индукции электропорации, связана с диаметром клеток.
Например, при размере щели между электродами 1 см для успешной
трансфекции ДНК в случае
Трансформация растительных клеток путем трансфекции ДНК.
213
лротопластов табака диаметром 40-44 мкм необходима напряженность поля 1,5
кВ/см2. При этом требуется довольно высокое напряжение- 1,5 кВ.
Для характеристики электрического импульса важно задать как амплитуду
(напряжение), так и постоянную спада. Постоянная спада - это время,
требующееся для снижения напряжения до 5% исходной величины (рис. 3.4).
Электропорирующий импульс создается при разрядке конденсатора в рабочей
камере, которая в самодельных и некоторых коммерческих устройствах
представляет собой два плоских металлических
ю
-Г-
Длительность импульса^ мкс (......)
.....Эпектропоратор
Kriiss
-:-Самодельный прибор
Ч
Ч
ч_
50
Длительность импупьса, мс (----)
Рис. 3.4. Характеристики электрического импульса, используемого для
электропорации.
электрода, помещенных в стерильную пластиковую кювету. Для электропорации
протопласты суспендируют между электродами в солевом растворе. Импульс
можно вывести на экран осциллографа, типичный импульс показан на рис.
3.4.
Упрощенная электрическая схема генератора импульсов для электропорации
представлена на рис. 3.5. Такие приборы легко изготовить специалистам по
электронике, но их использование сильно ограничено. Однако в настоящее
время доступны более совершенные фирменные приборы. Например,
усовершенствованный электропоратор Kriiss (ТА 750) способен с помощью
микропроцессорного устройства задавать импульс практически прямоугольной
формы с практически мгновенным спадом {рис. 3.4). Поскольку время спада
не имеет большого значения
214
Глава 3
для прибора этого типа, данный параметр заменен на длитель-г ность
