Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
- Фазово-контрастный микроскоп с объективом Nicon, ХЮ (или
равноценный).
- Центрифужные пробирки, содержащие по 1 мл свежеизолированных
протопластов в концентрации З.ХЮ8 клеток/мл (например, протопласты
суспензионной культуры альбиноса Petunia hybrida, приложение 3 [I]).
Растворы
- Плазмида со скринируемым маркерным геном для анализа временной
экспрессии (например, pCaMVCAT) в дистиллированной Н20 (150 мкл с
концентрацией 1 мкг/мл) на льду.
- Среда для культивирования протопластов (например, 80 мл MSP1 9М,
приложение 2 [II]).
- Среда для отмывания протопластов (например, 80 мл CPW 9М, приложение
2 [V]).
- Растворы для трансфекции ДНК (по 5 мл) в стандартных пробирках.
Например:
MSPC 9М (контроль)
5%-ный ПЭГ 6000 в MSP1 9М
10%-ный ПЭР 6000 в MSP1 9М приложение 2[Н]
20%-ный ПЭГ 6000 в MSP1 9М
3.2.2.2. Методика
Приготовление суспензионной культуры протопластов альбиноса Petunia
hybrida описано в приложении 3[1]. Методики получения суспензионной
культуры протопластов в других случаях и другие системы протопластов
должны быть разработаны с помощью специальных экспериментов.
1. Берут четырев> центрифужные пробирки, каждая из которых содержит по
2хЮ8 протопластов в 1 мл ростовой среды (например, MSP1 9М), - по одной
пробирке для каждой
206
Глава 3
концентрации ПЭГ:
Проба 1: 0%-ный ПЭГ.
Проба 2: 5%-ный ПЭГ.
Проба 3: 10%-ный ПЭГ.
Проба 4: 20Уо-ный ПЭГ.
Осаждают протопласты при 400 об/мин в течение 7 мин.
2. Удаляют супернатант с помощью стерильной пастеровской! пипетки,
оставляя тонкий слой среды на поверхности осадка.
3. Добавляют 20 мкл раствора плазмиды г> к осадку с помощью стерильного
наконечника автоматической микропипетки Gilson Р200. Осторожно
ресуспендируют осадок с помощью-пастеровской пипетки и оставляют при
комнатной температуре на 1 минд).
4. Добавляют к осадкам по 2 мл соответствующего раствора*)' ПЭГе> или
контрольного раствора (MSP1 9М), дав им стечь по стенке пробирки с высоты
1 см над осадком. Ресуспендируют протопласты путем вращения пробирки
между ладонями пока не будет получена тонкая суспензия. Инкубируют при
28°С3> 30 мин, иногда перемешивая.
5. Разводят инкубационную смесь, медленно добавляя 10 мл MSP1 9М (по 2
мл каждые 3 мин), и затем осаждают протопласты (400 об/мин, 10 мин)").
6. Осторожно ресуспендируют протопласты в 1 мл MSP1 9МК>.
7. Добавляют 10 мкл раствора ДНКазы. Инкубируют при комнатной
температуре 30 мин.
8. Добавляют 10 мл CPW 9М, осторожно перемешивают и затем осаждают
протопласты (400 об/мин, 10 мин). Отмывают еще раз в CPW 9М и
ресуспендируют в 1 мл CPW 9М.
9. Подсчитывают число выживших протопластов") с помощью"
гемоцитометрам>.
10. Переходят к процедуре выделения ДНК-
3*2.3. Выделение ДНК из протопластов и дот-блоттинг-гибридизация
3.2.3.1. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Материалы для олигонуклеотидного мечения и гибридиза^
ции ДНК (разд. 5.6 и 5.5).
- Водяная баня на 56 °С.
- Фильтр Hybond-N (Amersham, 8x3 см).
- Кипящая водяная баня.
- Вакуумная печь на.80°С.
Трансформация растительных клеток путем трансфекции ДНК
207
гРастворы
разд. 4.2.2.1.
- 3XSSC (разд. 5.4.2).
- Раствор ДНКазы (100 мкл в пробирке Эппендорф) на льду [4 мг/мл ДНКазы
I (Sigma) в 20 мМ MgCl2].
- Растворы для выделения ДНК (20 мл):
lXCTAB-буфер для экстракции •
ЗХСТАВ-буфер -"-
ЮхСТАВ-буфер ¦-"-
. СТАВ-буфер для осаждения
- 1М NaCl.
- 9%-ный маннитол в дистиллированной Н^О.
- Хлороформ/октанол (24:1) в стеклянных стандартных пробирках.
- Этанол (100%, 85%, 65%) в дистиллированной Н20.
- Стандартные растворы плазмиды (например, pCaMVCAT) для
реконструкционных экспериментов по дот-блоттинг-гиб-ридизацииа>:
Ах 1000 (1,15 нг/мкл)
ВХ500 (0,58 нг/мкл)
СХ 100 (0,12 нг/мкл)
DX50 (0,06 нг/мкл)
j
- Раствор для денатурации (1 М NaCl, 0,1 М NaOH, 10 мМ ЭДТА).
На 100 мл:
5 М NaCl 20,0 мл
NaOH 0,4 г
0,5 М ЭДТА, pH 8,0 2,0 мл.
5 мкл каждого во льду.
3.2.3.2. Методика
Выделение ДНК из протопластов
1. Отбирают равные по объему аликвоты (1-3 млн.л) протопластов),
помещают в пробирку Эппендорф и осаждают (1 мин). Ресуспендируют в 350
мкл 9%-ного маннитола.
2. Лизируют протопласты путем быстрого пипетирования с помощью
микропипетки Gilson Р1000 в 250 мкл ЗХСТАВ-буфера для экстракции.
Встряхивают, чтобы разбить возможные агрегаты дебриса растительных
клеток, и инкубируют при 46 °С 10 мин°>.
3. Дают остыть 5 мин и затем добавляют 500 мкл смеси хлороформ/октанол
(24:1), перемешивают до образования эмульсии, перевертывая пробирку.
208
Глава 3
4. Разделяют фазы путем центрифугирования (5 мин). Переносят водную фазу
(верхний слой) в чистую пробирку Эп-пендорф. На поверхность интерфазы
добавляют еще 100 мкл lXCTAB-буфера для экстракции, затем отсасывают его
и объединяют с ранее отобранной из той же пробирки водной фазой.
