Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 99

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 93 94 95 96 97 98 < 99 > 100 101 102 103 104 105 .. 184 >> Следующая

плазмиды увеличивает частоту трансформации от 5 до 20 раз [38]. Тепловой
шок можно провести между 5 и 30 мин перед добавлением ДНК, не уменьшая
эффективности обработки.
Показано, что добавление ПЭГ после ДНК увеличивает частоту
транс*
формации. Оптимальная концентрация ПЭГ составляет 6-15%.
•> Предполагаемые интервалы следующие:
Трансформация растительных клеток путем трансфекции Д1ГК 221
Тип прибора В/см Длительность
Высоковольтный/импульс малой дли 500---300 10---40 мкс
тельности
Низковольтиый/импульс большой дли 100---400 5---6 мс
тельности
ж> Объем камеры разумеется зависит от типа прибора: в некоторых
устройствах, особенно самодельных, используют пластиковне кюветы, в
других - пластины Costar, а в некоторых - специально изготовленные
камеры.
3) Здесь отсутствует этап отмывания.
н) Этого промежутка времени достаточно для экспрессий гена cat.
3.4. Трансформация растительных клеток путем микроинъекций
3.4.1. Основные положения
3.4.1.1. Общий подход к микроииъекции клеток
Техника микроинъекций, первоначально разработанная " 1970 г. для
клеток животных независимо А. Грассманном и> Е. Г. Дьякумакосом, в
настоящее время стала рутинным методом для введения небольших молекул,
макромолекул (ДНК,. РНК, белков), органелл и вирусных частиц в самые
различные животные клетки [4]. Методика основана на использовании
стеклянных микропипеток с диаметром кончика 0,5-10 мкм5. с помощью
которых осуществляют прямой перенос макромолекул в цитоплазму или в ядро
реципиентной клетки или органа. Последние иммобилизуют на твердой
подложке, искусственно связывают с субстратом или закрепляют посредством
пипетка с присоской [1, 17, 39].
Поскольку микроинъекция ДНК оказалась эффективным методом
трансформации животных клеток, различные группы-исследователей пытались
разработать подобные методы для трансформации клеток растений [14, 23,
26, 41]. Однако только недавно была показана возможность трансформации
растительных клеток путем прямых микроинъекций чужеродной ДНК в
протопласты [5, 6, 35]. Успех этих последних экспериментов, был
обусловлен главным образом разработкой таких методических подходов,
которые позволяют локализовать ядра и ориентировать протопласты таким
образом, чтобы чужеродная ДНК могла быть введена непосредственно в ядра
протопластов, без заметного снижения их выживаемости. Новые приемы спо-
222
Г лава 3
собствовали более успешной внутриядерной инъекции и благодаря этому
воспроизводимой трансформации.
Ниже указаны преимущества и недостатки техники микроинъекций для
трансформации растительных клеток.
Преимущества
- Для клеток животных сообщалось об очень высоких частотах
трансформации (15-60%); и, таким образом, метод может быть полезен в тех
случаях, когда доступно только небольшое количество клеток, протопластов
или органов.
- Метод позволяет вводить макромолекулы в цитоплазму или ядро.
- Среднее количество инъецированных макромолекул на клетку можно
оценить (приблизительно 0,1-1,0 мкл) и контролировать.
- Метод допускает наибольшую гибкость в выборе типа и размера молекул
или органелл, используемых в качестве донора (например, ДНК, хромосомы,
ядра, органеллы).
- Биологический эффект инъецированного материала можно оценить в
природном окружении и наблюдать после инъекции.
- Методика не требует обязательного удаления клеточной стенки и, таким
образом, может использоваться в случае тех видов растений, которые в
настоящее время не удается регенерировать из колоний, полученных на
основе протопластов. Это основная причина интереса к микроинъекциям.
Вполне вероятно, что в течение следующих нескольких лет
наибольшее внимание будет приковано к микроинъекциям клеток, способных к
эмбриогенезу, например клеток пыльцы, эм-бриогенных суспензионных культур
или изолированных семяпочек. Кроме того, мишенью могут стать клетки
развивающихся зачатков побегов или эмбриогенные ткани, ^изолированные
зародыши и т. п. Однако здесь могут возникать проблемы из-за развития
химерных растений.
Недостатки
- Метод относительно дорого наладить и для его воспроизведения
требуется высококвалифицированный и опытный персонал. Процесс чрезвычайно
медленный - квалифицированный работник способен инъецировать только 20-
100 клеток за день.
- Введение микропипетки может оказывать повреждающее действие на
реципиентные клетки.
- Для ядерной трансформации доставку чужеродной ДНК обычно необходимо
осуществлять непосредственно в ядро реципиентной клетки. Для
культивируемых животных кле-
Трансформация растительных клеток путем трансфекции ДНК
225
ток, которые уплощены, прикрепляются к твердому субстрату и не имеют
клеточной стенки, положение ядра в цитоплазме клетки не составляет
проблемы. Это справедливо и в отношении яйцеклеток млекопитающих. При
Предыдущая << 1 .. 93 94 95 96 97 98 < 99 > 100 101 102 103 104 105 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed