Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 94

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 88 89 90 91 92 93 < 94 > 95 96 97 98 99 100 .. 184 >> Следующая

векторной ДНК во время поглощения [31, 38, 42, 43]. Однако ясио, что
неспедифическая ДНК-носитель тоже включается в ядерный геном
трансформированных тканей растения; последствия этого процесса в
настоящее время ие известны. Добавление векторной ДНК в виде копре-
ципитата с фосфатом кальция может быть предпочтительнее [21]. В этом
случае состав поддерживающих сред для протопластов может быть изменен.
Есть некоторые даииые, что более высокие частоты трансформации могут быть
получены при использовании ДНК вектора, переведенной в лииейиую форму. л>
После добавления плазмиды время до внесения ПЭГ без ущерба для процедуры
трансформации может составлять 5 мин [42].
е) Используемый авторами книги ПЭГ 6000 был поставлен фирмой Koch-Light
Laboratories несколько лет назад и с тех пор они успешно с ним работают.
Разумно проверить несколько образцов ПЭГ 6000 от различных поставщиков,
поскольку качество ПЭГ 6000 значительно варьирует. Как правило,
низкомолекулярные примеси, например токоферол, частично обусловливают
характеристики этого вещества, влияющие на стимуляцию слияния и эндо-
цитоз. Часто случается, что одна партия ПЭГ может быть вредной для клеток
при используемых высоких концентрациях, а другая - нет.
*> Вполне вероятно, что оптимальная концентрация ПЭГ должна быть
уменьшена. . В большинстве случаев необходимо уравновесить эффективное
поглощение ДНК с приемлемым уровнем потерь протопластов. Кроме того,
следует отметить, что протопласты, выделенные из некоторых источников,
при высоких концентрациях ПЭГ могут формировать агрегаты и/или сливаться.
Трансформация растительных клеток путем трансфекции ДНК. 211
3) Для оптимизации частоты трансформации или эндоцитоза ДНК можно
тестировать температуру инкубации в интервале 20-35 °С и длительность
обработки ПЭГ. я> Раствор кальция с высокой ионной силой, такой, как F-
среда [21], в некоторых системах может обеспечить лучшее поглощение ДНК,
но часто-вызывает массовую агрегацию протопластов и снижение
выживаемости. Необходимо подобрать скорость и продолжительность
центрифугирования, чтобы обеспечить осаждение протопластов с минимальными
повреждениями.
На этой стадии протопласты можно дважды отмыть MSP1 9М, определить
жизнеспособность популяции, высеять клетки и культивировать как обычно
(разд. 2.8). Трансформированные колонии можно отбирать, как описано в
разд. 2.9, если использовались соответствующие селективные' маркерные
гены (например, Ктг илн Нтг). В противном случае через-пару дней
инкубации в культуре можно анализировать временную экспрессию ДНК,
захваченной путем эндоцитоза, с помощью САТ-анализа-(разд. 6.4.2), чтобы
получить доказательство эффективности поглощения ДНК в присутствии ПЭГ.
Обычно мы используем для поглощения плазмиды 15%-ный ПЭГ и получаем
разумную активность CAT через 48% культ ив ир ов ан ия.
Чтобы улучшить эффективность высева протопластов после поглощения ДНК,
можно разделить поврежденные я интактные протопласты с помощью
дифференциального центрифугирования в градиенте плотности. Для этого
обычно протопласты центрифугируют в/на среде, которая' имеет то же
осмотическое' давление, что и раствор для поглощения' ДНК, но большую
плотность. Например, протопласты, отмытые в растворе, содержащем 13% (вес
на объем) маннитола, можно ресуспенди-ровать в растворе, содержащем 21%
(вес на объем) сахарозы, без осмотического шока. При центрифугировании
(400 об/мин, 10 мин) интактные протопласты будут флотировать, образуя
компактную зону на: поверхности раствора, тогда как более плотный дебрис
будет осаждаться. Аналогичным образом можио использовать градиенты
перколла или фиколла. Альтернатива заключается в осаждении через плотную
сахарозную подушку, которая удерживает менее плотные протопласты наг
своей поверхности.
л) После обработки ПЭГ протопласты находятся "в стрессовом состоянии",,
и необходимо обеспечить их восстановление путем культивирования в течение
нескольких дней при высокой плотности высева (105 жизнеспособных
протопластов в 1 мл), часто в присутствии фидерных культур4
необработанных протопластов. Следует регулярно следить за формированием
клеточной стенки и поддерживать плотность клеток иа уровне-около 5ХЮ4 в 1
мл до наступления первого деления. Селекцию трансформантов можио
осуществлять, как описано в разд. 2.9.3 (совместное-культивирование
клеток с агробактериями).
Обработка растворами ПЭГ 6000 может оказаться слишком жесткой для*
более хрупких систем протопластов. В этом случае целесообразно
использовать ПЭГ с меньшей массой, но для достижения трансфекции могут
понадобиться более высокие концентрации.
и) Для сравнительной оценки поглощения вектора важно экстрагировать-
равные количества интактных протопластов из каждого образца. Если вам ие
удалось выделить достаточно протопластов, то соответственно-
скорректируйте результаты.
0) Возможные проблемы, возникающие при выделении ДНК из клеток с помощью
метода, в котором используется СТАВ, детально описаны в-1 разд. 4.2.3.
Предыдущая << 1 .. 88 89 90 91 92 93 < 94 > 95 96 97 98 99 100 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed