Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 89

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 83 84 85 86 87 88 < 89 > 90 91 92 93 94 95 .. 184 >> Следующая

получения эффективной трансформации протопластов Ti -плазмидой,
обеспечивают и оптимальное поглощение малых плазмидных векторов [9, 11].
В настоящее время эндоцитоз с помощью ПЭГ и электропорация могут быть
использованы для эффективного включения малых векторных плазмид в
протопласты с частотой трансформации от 10-4 до 2-10-2 ([15, 31, 38].
Введение векторной ДНК в синхронизированные протопласты, находящиеся в S-
фазе и митозе, повышает эффективность трансформации еще в 3-5 раз [25,
30]. Высказано предположе-
Множественный клонирующий сайт для встраивания чужеродной ДНК
Трансформация растительных клеток путем трансфекции ДНК__________199
ние, что отсутствие ядерной мембраны в митотических клетках способствует
проникновению ДНК в ядра [30]. Особенно важно отметить, что методы
переноса генов посредством ДНК (DMGT) можно использовать для
трансформации протопластов как однодольных, так и двудольных растений. В
этом случае трансформация уже не зависит от того, происходит ли
экспрессия селективных маркерных генов или резистентности к антибиотикам
в качестве селективного признака [24, 42].
Как и при трансформации с помощью целой Ti-плазмиды, быстро
выяснилось, что повторы длиной 25 п. н., встроенные в малые DMGT-векторы,
не используются для интеграции в растительную ДНК, и, таким образом, их
необязательно вводить в состав вектора. Действительно, было обнаружено,
что любые участки вектора могут рекомбинировать с ДНК клетки-хозяина. По
этой причине в результате трансформации возникают клетки, содержащие
самое различное число копий перенесенного гена и самые разнообразные
вставки, включая отдельные копии плазмиды, фрагменты плазмид, конкатемеры
и перемешанные последовательности вектора.
3.1.4. Векторы для переноса генов посредством ДНК (DMGT-векторы)
Прямой перенос генов в протопласты обычно осуществляют либо для
получения стабильно трансформированных клеточных линий, либо для проверки
временной экспрессии гена с целью тестирования новых конструкций. В
последнем случае практически любой малый клонирующий вектор можно
использовать для доставки нужного гена, тогда как для получения
стабильной трансформации DMGT-вектор должен нести эффективно
экспрессирующийся селективный маркерный ген, например ген устойчивости к
канамицину или гигромицину (табл 2.1). Кроме того, векторы с эффективно
экспрессирующимися конструкциями, кодирующими продукт, для тестирования
которого известен чувствительный метод (например, pCaMVCAT), часто
используют в экспериментах по временной экспрессии, цель которых состоит
в оптимизации процедуры стабильной трансформации.
3.1.4.1. DMGT-векторы для траизиториой экспрессии
Один из векторов, специально созданный для переноса генов посредством
ДНК,- это pCaMVCAT [12]. Он представляет собой малый клонирующий вектор
(рис. 3.2), несущий ген хло-рамфениколацетилтрансферазы (CAT) под
контролем промотора 35S РНК из генома CaMV. Промотор CaMV-35S
обеспечивает интенсивную нерегулируемую экспрессию перенесенных
200
Глава 3
генов в трансгенных растениях [32, 37]. Данный вектор очень полезен для
разработки эффективных систем доставки ДНК, поскольку за активностью CAT
можно следить с помощью очень чувствительного метода (табл. 2.1 и разд.
6.4.2.3), что позволяет оценивать биологическую активность векторной ДНК
вскоре после ее поглощения. Недавно различные группы исследователей
разработали векторы специально для переноса генов посредством ДНК,
которые содержат кассеты для экспрессии генов, состоящие из
мультилинкерного сайта, встроенного между сильным промотором и сайтом
присоединения poly (А) [2, 32]. Данные векторы удобны для управления
экспрессией
Eco RI
Рис. 3.2. Рестрикционная карта pCaMVCAT. ApR - резистентность к
ампициллину; ВВ*-липкие концы, образуемые рестриктазами ВатШ и Bglll,
были соединены таким образом, что в месте стыка рестрикционный, сайт не
сохранился. (ВМЦК тождественно CaMV.)
любого гена, который может быть встроен в полилинкерный сайт. Таким
образом, можно исследовать активность гена с помощью временной
экспрессии.
3.1.4.2. DMGT-векторы для стабильной трансформации
Многие удачные DMGT-системы включали небольшие промежуточные векторы,
которые обычно используют с неонкогенными ^ыс-действующими системами tnV-
помощников (табл. 1.1). К таким векторам относятся pGV1103 и pMON200 [15,
36], и, хотя они содержат по крайней мере один повтор длиной 25 п.н., он
не используется при интеграции с ядерным геномом растения. Небольшие
бинарные векторы, например pBin 19, тоже очень удобны для экспериментов
по DMGT-трансформации. Для стабильной трансформации конструкцию с CAT
обычно заменяют на доминантный селективный маркер, такой, как ген
резистентности к канамицину [13, 31, 43].
Трансформация растительных клеток путем трансфекции ДНК
201
После поглощения ДНК протопластам дают возможность восстановить
клеточную стенку и поделиться, прежде чем трансформированные колонии
Предыдущая << 1 .. 83 84 85 86 87 88 < 89 > 90 91 92 93 94 95 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed