Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
в функциональный светопродуцирующий фермент. Это позволяет количественно
оценить временную экспрессию в трансфицированных протопластах путем
измерения светового излучения.
3.3.1.4. Стабильная трансформация
С помощью электропорации были получены стабильно трансформированные
растения или клеточные линии некоторых видов растений. К их числу
относятся табак [38], морковь [22] и кукуруза [13]. Шиллито с соавторами
[38] использовал вектор, содержащий доминантный селективный маркерный ген
(npt-ll)у который ранее успешно применяли в экспериментах по пере* носу
генов с помощью ПЭГ [31]. Эту плазмиду вводили с помощью электропорации в
протопласты табака и отбирали трансформанты на основе резистентности к
канамицину. Дан<-ные исследования, очевидно, отнимают больше времени, чем
эксперименты по временной экспрессии, но в конечном итоге позволяют
разработать методику стабильной трансформации. В настоящее время при
использовании методов электропорации частота трансформированных колоний
может достигать 2%, что более эффективно, чем трансфекция ДНК с помощью
ПЭГ. Пути интеграции перенесенной ДНК такие же, как и при ис* пользовании
ПЭГ, и в обоих случаях перенесенные гены наследуются в соответствии с
нормальными менделевскими соотношениями.
3.3.2. Оптимизация методик электропорации с помощью временной
экспрессии
3.3.2.1. Основные положения
Один из подходов к определению оптимальных условий для электропорации
протопластов состоит в анализе временной экспрессии гена в составе ДНК,
которую вводят в клетки.
Трансформация растительных клеток путем трансфекции ДНК
217
В этом отношении очень удобна конструкция CaMV-35S-cat. Этот химерный
ген образуется при слиянии между промоторной областью 35S РНК вируса
мозаики цветной капусты и кодирующей областью бактериального гена
хлорамфениколацетил-трансферазы [12]. Промотор CaMV-35S - один из
сильнейших конститутивных промоторов, идентифицированных до сих пор; он
обеспечивает эффективную экспрессию связанного с ним гена в самых
разнообразных растениях. Разработан удобный и чувствительный метод
определения CAT как в животных, так и в растительных клетках (разд.
6.4.2). Это сочетание интенсивной экспрессии и чувствительного метода
анализа объясняет столь широкое использование CaMV-35S-cat в векторах для
временной экспрессии, таких, как небольшая плазмида pCaMVCAT (рис. 3.2).
Независимо от исследуемого параметра электропорации, общий принцип
эксперимента состоит в том, что постоянное количество протопластов
обрабатывают в присутствии плазмиды, несущей ген cat (например,
pCaMVCAT), культивируют в течение 24-48 ч, чтобы обеспечить экспрессию
тена, и анализируют активность CAT (разд. 6.4.2). В последнее время
появились различные фирменные приборы, поэтому дать обобщенное описание
обращения с "электропоратором" трудно. В одних приборах используется
экспоненциальный спад импульсов, в других - прямоугольные импульсы. Эти
приборы можно классифицировать далее в зависимости от того, дают ли они
высоко- или низковольтный импульс.
В эксперименте необходимо рассматривать следующие параметры:
- Напряжение и длительность импульса: для приборов, генерирующих
прямоугольные импульсы большой амплитуды, эти параметры составляют 500-
5000 В/см и 10-50 мкс [28]. Низковольтные приборы данного типа генерируют
импульсы 500-1000 В/см длительностью 2-60 мс. При использовании приборов
с экспоненциальным спадом более уместно говорить о времени спада
импульса, чем о его длительности. Для них напряжение составляет 100-1000
В/см и импульс может длиться 5-60 мс [12, 29].
- Число и частота импульсов: при условии, что напряжение и длительность
импульса оптимизированы, не представляется необходимым давать более
одного импульса [28, 29].
- Среда: первоначально рекомендуется использовать среду для
культивирования нормальных протопластов, прежде чем испытывать растворы,
составленные специально для элект-ропорацииа).
218
Глава 3
3.3.2.2. Обеспечение
Оборудование и приспособления
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических ио следований
(приложение 1 [I]).
- Обычные материалы для культуры тканей (приложение-
- Электропоратор Kruss (модель ТА 750): это многоцелевой прибор с
высоковольтным прямоугольным импульсом с длительностью 8-999 мкс и
максимальной амплитудой 750 В-(что соответствует напряженности поля,
большей чем 3000 В/см). Нижеследующие методики основаны на использовании
этого прибора.
- Водяная баня на 45 °С.
- Фазово-контрастный микроскоп Nikon.
- Гемоцитометр (конструкции Фукса - Розенталя).
Растворы
- Свежевыделенные протопласты (например, клетки альбиноса Petunia
hybrida, сорт Blue Lace, приложение 3 [I]) в концентрации 4хЮ6 в 1 мл в
среде для электропорации2). Комментарии к процедуре выделения
протопластов см. " разд. 2.7.
- Раствор векторной ДНК (например, pCaMVCAT) в концентрации 250 мкг/мл
в стерильной дистиллированной НгО.
- Раствор ПЭГД) в культуральной среде (например, для* P. hybrida
