Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
5. Добавляют 60 мкл 10%-ного СТАВ-буфера к водной фазе. Перемешивают и
затем повторяют экстракцию смесью хло-роформ/октанол (24:1). На этот раз
удаляют водную фазу очень тщательно (избегая попадания дебриса) в новую
пробирку Эппендорф и добавляют равный объем СТАВ-буфера для осаждения
(приблизительно 600 мкл). Оставляют при комнатной температуре на 20 мин
для осаждения.
6. Собирают осадок путем кратного (2-10 с) осаждения в микроцентрифуге.
Важно, чтобы осадок не был слишком компактным, в противном случае его
очень трудно растворить.
7. Растворяют осадок в 400 мкл 1 М NaCl (нагревают до 56 °С, если
необходимо) и переносят в чистую пробирку Эппендорф. Добавляют два объема
100%-ного этанола (800 мкл)> и осаждают нуклеиновые кислоты при -70 °С в
течение 20-30 мин в бане сухой лед/этанол.
8. Собирают осадок нуклеиновых кислот (3 мин) и дважды промывают 65%-ным
этанолом и один раз 85%-ным. Если осадок всплыл, то центрифугирование
повторяют (3 мин)п).
9. Высушивают под вакуумом и приступают к процедуре дот-блоттинг-
гибридизациир).
Оценка количества вектора, захваченного при эндоцитозе, путем дот-
блоттинг-гибридизации
1. Снова растворяют каждый образец в 4 мкл раствора для денатурации.
2. Прогревают 5 мин при 100 °С на кипящей водяной бане. Одновременно
следует прокипятить образцы ДНК для эксперимента по реконструкции.
3. Берут фильтр Hybond-N размером 8x3 см и отмечают карандашом 8 пятен (2
ряда по 4 точки).
4. Осторожно наносят образцы на фильтр Hybond-N с помощью микропипетки
Gilson Р20, один образец на каждую точку в одном ряду, записав порядок
нанесения. На точки в другом ряду наносят по 4 мкл образцов ДНК для
эксперимента по реконструкции.
5. Подсушивают фильтр 3 мин, а затем ополаскивают в 3XSSC' в течение 2
мин. Помещают между согнутыми в несколько' слоев листами фильтровальной
бумаги Whatman 3 ММ,, а затем прогревают в печи 30 мин при 80 °G.
Фиксируют
Трансформация растительных клеток путем трансфекции ДИК
209>
ДНК на фильтре Hybond-N путем облучения ультрафиолетом (разд.
5.4.3)с).
6. Приступают к процедуре гибридизации и авторадиографии? (разд. 5.5),
используя в данном случае радиоактивно меченный фрагмент векторной
плазмиды pCaMVCAT в качестве-пробы (разд. 6.2.).
7. Пример типичных результатов дот-блоттинг-гибридизации и> данные по
выживаемости протопластов из эксперимента ПО' трансфекции ДНК с помощью
ПЭГ представлены на рис. 3.3-и в табл. 3.1 соответственно. Можно оценить
количество" ДНК, захваченной при эндоцитозе после каждой обработки
Концентрация 6 ' в
ПЭГ, %
'Эксперимент по; х 80 х 108
реконструкции
щ
Рис. 3.3. Оценка эффективности трансфекции протопластов P. hybrida с
помощью ПЭГ путем дот-блоттинг-гибридизации ДНК. Показаны результаты
рекоиструкциониого эксперимента по дот-гибридизации: Х50, X100, Х500* и
хЮОО копий плазмиды иа протопласт и влияяие концентрации ПЭГ на
поглощение плазмиды.
ПЭГ, путем сравнения интенсивности сигнала гибридизации' на
радиоавтографах дотов экспериментальных образцов по* сравнению с
контрольными.
Выбирают 'подходящую концентрацию ПЭГ для будущего* анализа временной
экспрессии и экспериментов по трансформации, которая бы обеспечивала
хорошее поглощение вектора; и адекватную выживаемость протопластов. В
данном эксперименте эта концентрация составляет 20%.
Примечания
*> Подобные стандартные растворы плазмид приготавливают таким образом,
чтобы получить определенное число копий векторной плазмиды по* отношению
к числу выделенных протопластов (1 млн.!). 4 мкл каждого"
10 20
г 500 х 1000
"
210
Глава 3
Таблица 3.1. Выживаемость протопластов в результате поглощения ДНК в
присутствии ПЭГ
Концентрация ПЭГ, % Выживаемость прото Число копий плазмиды
пластов, % на протопласт
0 52 <50
5 50 100
10 46 250
20 42 1000
¦раствора содержат эквивалент АХ ЮОО,
ВХ500,
схюо,
DX50 копий плазмиды на выделенный протопласт.
в) Данный эксперимент можно осуществить в полустерильных условиях при
попытках оптимизации условий поглощения ДНК. Однако, используя метод для
трансформации, следует принимать строгие предосторожности в отношении
стерильности.
(r)> В системах, где протопласты можно выделить только в небольших
количествах, процедура трансфекции может осуществляться в уменьшенном
масштабе путем соответствующего доведения объемов. В этих условиях иногда
предпочтительнее использовать камеры для микрокультивирования и питающие
культуры (разд. 3.4.2.3). г> В некоторых успешных методиках поглощения
ДНК с помощью ПЭГ используют ДНК-носитель преимущественно для того, чтобы
нейтрализовать влияние любого иеспецифического связывания или деградации
