Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 91

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 85 86 87 88 89 90 < 91 > 92 93 94 95 96 97 .. 184 >> Следующая

разработаны именно для этих протопластов и в случае других может
потребоваться оптимизация методики (см. примечания).
В разд. 3.2 мы остановимся на том, как определить оптимальные условия
для введения векторной ДНК в протопласты в присутствии ПЭГ, оценивая
количество используемой ДНК. Поглощение ДНК контролируется с помощью
гибридизации, чтобы подтвердить включение векторной ДНК в протопласты. В
разд. 3.3 изложены методики электропорации протопластов и оценки
эффективности процесса трансформации путем измерения временной экспрессии
DMGT-вектора в клетках, полученных из обработанных протопластов.
Трансформация протопластов путем микроинъекций описана в разд. 3.4.
3.2. Трансфекция протопластов с помощью полиэтиленгликоля
3.2.1. Основные положения
Полиэтиленгликоль представляет собой сильно гидрофильное вещество и
способен связывать много "свободной воды" в растворе; "свободная вода" -
это молекулы, доступные для взаимодействия с заряженными молекулами
(обычно ионами), растворенными в воде. Таким образом, при высоких
концентрациях ПЭГ такие макромолекулы, как ДНК, больше не могут
оставаться в растворе и осаждаются. Мембрана протопласта в норме
отрицательно заряжена. Благодаря фосфатным группам ДНК тоже имеет
отрицательный заряд, и, следовательно, взаимное отталкивание зарядов
препятствует взаимодействию между ДНК и протопластами. При очень высоких
концентрациях (30-40% вес на объем) ПЭГ также, по-видимому, минимизирует
взаимное отталкивание зарядов; таким образом, клеточные мембраны могут
прийти в тесный контакт с возможным слиянием липидных бислоев и
впоследствии после разведения со слиянием клеток. Было показано, что
полиэтиленгликоль представляет собой и сильный стимулятор эндоцитоза у
протопластов растений; при добавлении ПЭГ они способны поглощать большие
частицы, например целые хлоропласты, липосомы или
204
Глава 3
бактерии. Таким образом, общий механизм воздействия ПЭГ не совсем ясен,
однако, вероятно, подразумевает преципитацию плазмидной ДНК на
плазматической мембране и затем стимуляцию ее поглощения путем
эндоцитоза.
Многие другие гидрофильные полимеры с длинной цепью (например,
поливиниловый спирт), длинноцепочечные катионы (например, поли-а-орнитин,
поли-а-лизин и полианион дек-странсульфат) и высокие концентрации
дивалентных ионов (например, Zn2+ и Си2+) тоже использовались для
стимуляции поглощения ДНК [9]. В отличие от остальных веществ ПЭГ гораздо
менее токсичен по отношению к большинству протопластов, и, как правило,
можно подобрать такую концентрацию, при которой достигается хороший
уровень поглощения ДНК при незначительном повреждении клеток.
Концентрация ПЭГ 6000 в интервале 15-25% и 5 мкг плазмиды на 106
протопластов могут стимулировать поглощение до 1000 копий плазмиды на
протопласт [11]. Существуют некоторые основания считать, что частота
трансформации возрастает с концентрацией векторной ДНК. Верхний предел
количества ДНК, которое может взаимодействовать с протопластами в
присутствии ПЭГ не вызывая заметных повреждений, вероятно, составляет
около 50-200 мкг на 106 протопластов в зависимости от источника
последних. Если используют более высокие, чем 25%, концентрации ПЭГ, то
увеличиваются и степень повреждения клеток, и частота их слияния, что
затрудняет получение трансформантов.
В данном разделе мы останавливаемся на том, как определить оптимальную
концентрацию ПЭГ 6000 для эффективного поглощения плазмиды протопластами
растений. Однако ту же самую схему можно использовать и для оптимизации
других параметров (например, подбора ДНК-носителя, среды для поглощения,
pH, времени и температуры инкубации, концентрации' ДНК, условий
перемешивания и предварительной обработки протопластов), которые
предположительно влияют на процесс поглощения. После стимуляции
эндоцитоза любая плазмида, адсорбированная на внешней стороне
протопластов, удаляется с помощью ДНКазы. Затем из заданного количества
протопластов выделяют суммарную ДНК и оценивают количество встроенного в
нее вектора с помощью ДНК-ДНК-гибридизации, используя радиоактивно
меченную ДНК вектора в качестве пробы. Кроме того, для установления
целостности поглощенной векторной ДНК можно использовать блоттинг-
гибридизацию по Саузерну :[11]. Такие методы в сочетании с анализом
временной экспрессии вектора в обработанных плазмидой клетках позволяют
быстро оптимизировать процедуры трансформации с помощью ПЭГ.
Трансформация растительных клеток путем трансфекции ДНК__________205
3.2.2. Стимулируемое ПЭГ поглощение ДНК протопластами6)
3.2.2.1. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований и
материалы для культуры тканей (приложения 1[1] и 2[1]).
- Настольная центрифуга MSE Centaur 2 (или равноценная).
- Стерильные центрифужные пробирки на 13 мл (например, Sarstedt, тип
67.540), Х20.
- Водяная баня на 28 °С.
- Гемоцитометр (конструкции Фукса - Розенталя).
Предыдущая << 1 .. 85 86 87 88 89 90 < 91 > 92 93 94 95 96 97 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed