Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 100

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 94 95 96 97 98 99 < 100 > 101 102 103 104 105 106 .. 184 >> Следующая

работе с растительными клетками очень трудно проколоть клеточную стенку
без забивания кончика иглы. Наличие клеточной стенки и форма растительных
клеток затрудняют визуализацию ядра. Если клетка иммобилизована в
неправильной ориентации* то практически невозможно попасть в ядро, не
разрывая вакуоль, что вызывает немедленную гибель клетки. Иммобилизация
сама по себе тоже способствует некоторому повреждению протопластов.
- Для выращивания микроинъецированных клеток требуются специальные
методы культивирования, например в микрокаплях или с применением фидерной
культуры.
3.4.2. Трансформация растений путем микроинъекций
3.4.2.1. Основные положения
Несмотря на описанные выше проблемы в разработке методов
микроинъекций для растительных клеток, особенно протопластов, достигнут
большой прогресс. В ранних исследованиях проводили инъекции в цитоплазму
протопластов табака при 70%-ной выживаемости [40]. В этих экспериментах
использовали клетки двух-, трехдневного возраста, полученные из
протопластов, которые сформировали тонкую клеточную стенку ц способны
прикрепляться к покровному стеклу, покрытому по-ли-Ь-лизином (рис.
3.7,Л). За микроинъекцией наблюдали,, вводя флуоресцентный краситель
(Lucifer yellow). Однако игла микроинъектора редко попадала в ядро из-за
того, что при использовании этого метода иммобилизации
протопластов/клеток трудно локализовать ядра. С тех пор сообщалось, что
поли-L-лизин часто обладает токсическим действием по отношению к
протопластам.
Более поздняя разработка заключается в том, чтобы заплав-лять
протопласты в очень тонкий слой легкоплавкой агарозы в найлоновом кольце
[23]. Благодаря данному методу иммобилизации, многие протопласты
находятся у поверхности агарозы и только частично окружены ею, так что их
нетрудно инъецировать (рис. 3.7,5). При этом локализация ядра - непроста(r)
задача. Преимущество метода состоит в том, что инъецируемые протопласты
(клетки) уже находятся в культуральной среде,, обеспечивающей поддержание
их жизнеспособности. Разработан еще один метод, предусматривающий
иммобилизацию протопластов с помощью специально предназначенной
"удержива-
224
Глава 3
-ющей пипетки" (рис. 3.7,В). Протопласт можно втянуть или освободить,
прикладывая положительное или отрицательное давление к удерживающей
пипетке, соединенной со шприцем. Метод допускает манипуляцию
протопластами для оптимальной ориентации ядра относительно инъекционной
пипетки. Как указывалось ранее, с помощью данного метода иммобилизации
Кроссвей с соавторами [5] впервые показали возможность трансформации
клеток растений путем инъекции чужеродной
днк.
Чтобы легко визуализировать ядро иммобилизованных протопластов
(клеток) для инъекции чужеродной ДНК, обычно используют инвертированный
микроскоп, снабженный дифференциальной интерференционной оптикой
(Nomarski). Кроме того,
Рис. 3.7. Методы иммобилизации протопластов для микроинъекцнн.
so многих случаях удобно окрашивать ядра ДНК-специфичны-ми
флуоресцентными красителями, не снижающими жизнеспособность (Hoechest
33258), и визуализировать протопласты (клетки) с помощью инвертированного
микроскопа, снабженного эпифлуоресцентной оптикой [35]. Микроинъекции
осуществляют под объективом Х40 инвертированного микроскопа тонкой
микропипеткой, изготовленной с помощью "вытягива-теля пипеток".
Микропипетку сначала заполняют раствором для инъекций, а затем направляют
в иммобилизованный протопласт/клетку, используя "микроманипулятор". После
введения микропипетки в ядро соответствующий объем инъецируемого раствора
переносится в него путем вдувания или под давлением с помощью шприца,
соединенного одним концом с -микропипеткой, а другим - с системой
регуляции давления.
Трансформация растительных клеток путем трансфекции ДНК
225
Если клетки иммобилизованы на предметном стекле или в агарозе, то ядра
обычно инокулируют после того, как клеткам дали время восстановиться,
обычно в конце первого дня после прикрепления или заплавления. Очень
удобно иммобилизовать клетки на специальной микроскопической пластинке с
нанесенной сеткой. Это позволяет локализовать отдельные клетки в любое
время до или после инъекции с помощью видеозаписи. Таким образом можно
следить за их развитием и предпринять соответствующие действия, чтобы
обеспечить их рост в культуре. Если используются удерживающие пипетки, то
протопласты следует выделять из жидкой культуры на стадии, когда они
компетентны для трансформации (разд. 2.9.3), проводить инъ-
А Метод, предусматривающий использование найлоновой марли
Б Висячие микрокапди
Микрокапли объемом 50 мкп с микроинъецированнымн протоппастами
Капли среды
для предотвращение
высыхания
Рис. 3,8. Фидерная культура и культивирование микроинъецированных прото-
шластов в висячей капле.
екции и затем культивировать в таких условиях, чтобы их можно было
идентифицировать. В большинстве случаев инокулированные протопласты
Предыдущая << 1 .. 94 95 96 97 98 99 < 100 > 101 102 103 104 105 106 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed