Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
импульса. Возможности прибора позволяют легко и точ* но изменять
различные параметры электропорации (напряжение, длительность импульса,
число импульсов и время между импульсами).
3.3.1.2. Электропорация протопластов растений
Перенос генов путем электропорации был разработан для протопластов
растений, и в течение последних нескольких лет
S1
-О О-
С1
HFh
С2
ньн
-j-г.
LL
сз
С4
Напряжение: 0-700 В Время спада: 54 мс
Источник
напряжения
R1:
:r2
S4
Электроды
R3
1 -vW-o о S3
/v_
Осциплограф
Рис. 3.5. Принципиальная схема самодельного иизковольтиого устройства
для электропорации с экспоненциальным типом спада импульса.
появилось несколько сообщений об успешном применении данного метода [12,
13, 38]. При условии выживания протопластов после обработки
электрическими импульсами число используемых клеток и проблемы, связанные
с селекцией трансформированных клеток, идентичны таковым, которые
возникают при трансформации протопластов с помощью ПЭГ (разд. 3.2).
Существуют в принципе два различных подхода к применению электропорации.
ДНК можно успешно вводить в прото"-
Трансформация растительных клеток путем трансфекции ДНК
215
пласты, используя либо высоковольтный импульс малой длительности,
например 1,5 кВ в течение 10 мкс [38], либо низковольтный импульс гораздо
большей длительности, например 350 В в течение 54 мс [12]. Эта последняя
процедура более контролируема и, возможно, в будущем найдет широкое
применение.
Разработка и последующая оптимизация методики электропорации
специально для трансформации протопластов растений была в основном
осуществлена с помощью двух различных подходов.
1. Временная экспрессия векторной ДНК в популяции обработанных
протопластов. Для этого требуется измерить активность фермента,
кодируемого вектором, например CAT, в грубых лизатах протопластов,
подвергшихся электропорации [12].
2. Стабильная трансформация и селекция трансформированных колоний [38]. В
этом случае необходимо определение частоты стабильно трансформированных
колоний, образующихся в результате различных процедур электропорации.
3.3.1.3. Временная экспрессия
Работа, проведенная Фроммом с соавторами [12], помогла определить
условия, дающие максимальную экспрессию легко сканируемого продукта
индикаторного гена (хлорамфеникола-цетилтрансферазы, CAT) после
электропорации протопластов векторной ДНК, несущей этот ген (анализ
данного фермента описан в разд. 6.4.2). В этих экспериментах было
показано, что эффективность электропорации, которая измеряется
количеством ДНК, поглощенной протопластами, можно количественно связать с
активностью CAT. Поэтому оптимизация методики электропорации заключается
в том, чтобы подвергать популяцию протопластов различным по напряжению,
длительности и времени спада импульсам, а также использовать серии
импульсов, а затем анализировать через соответствующее время активность
CAT. Результаты таких экспериментов менее прямые, чем кажется на первый
взгляд, поскольку увеличение напряжения и длительности импульса приводит
к пропорциональному увеличению гибели клеток. В результате величина
активности CAT, выявленной в популяции протопластов, недооценивает
количество вектора, включенного каждой клеткой. Поэтому эффективность
электропорации зависит от того, измеряют ли ее на всей исходной популяции
или на тех клетках, которые остаются жизнеспособными после обработки.
Фромм с соавторами [12] сообщил, что импульс длительностью 54 мс при 350
В обеспечивает максимальную активность CAT и она достигает пика через 24-
48 ч после электропорации. Однако
216
Глава 3
подобные результаты, хотя и очень обнадеживающие, не дают каких-либо
сведений относительно доли клеточной популяции, активно продуцирующей
CAT. Более того, условия, наиболее благоприятные для временной
экспрессии, не обязательно обеспечивают стабильную трансформацию. Недавно
в некоторых неопубликованных работах, где 35S промотор ВМЦК соединяли с
кодирующей областью р-галактозидазы, утверждалось, что возможно
определение числа протопластов, в которых идет экспрессия конструкции,
путем реакции с X-GAL (см. pBin 19 в разд. 1.1.5). Аналогично этому Конч
с соавторами [20] сообщил, что бактериальная люцифераза, которая состоит
из двух различных белковых субъединиц, в протопластах растений собирается
