Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
культивируют в виде отдельных клеток на фидерных культурах или в
микрокаплях (рис. 3.8). Эффективность высева после инъекции обычно
уменьшается на 10-70%, но если используется эффективная техника
микрокультивирования, это не представляет большой проблемы, поскольку
частоты трансформации очень высоки (в среднем 15- 25%!). Блоттинг-
гибридизация по Саузерну показала, что трансформанты, образующиеся из
микроинъецированных клеток, содержат перенесенную ДНК. организованную так
же, как
226
Глава 3
и при использовании других систем трансфекции. Наследование генов,
введенных с помощью микроинъекций, не должно отличаться от такового при
трансформации растений другим методом.
Цель данного раздела - ознакомить исследователей с некоторыми
методиками микроинъекций с целью трансформации растительных клеток.
3.4.2.2. Обеспечение
Оборудование и приспособления
- Обычное оборудование для культуры тканей (приложение
2[Ч).
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1 [I]).
- Микроскоп: для микроинъекций можно использовать любой инвертированный
микроскоп с высоким увеличением хорошего качества (например, Nikon TMD;
Leitz Diavert) с большим рабочим расстоянием конденсора, фазово-
контрастной оптикой и оборудованный эпифлуоресцентной и/или
дифференциальной интерференционной оптикой. Микроскоп должен быть прочно
зафиксирован, и всю систему необходимо поместить на противовибрационный
стол в ламинарном боксе. Для наблюдения за протопластами требуется
объектив X 10, а для визуализации ядер и самих инъекций- объектив Х40.
- Микроманипулятор: для микроинъекций можно использовать любой
микроманипулятор, который контролирует перемещения во всех трех
направлениях и допускает физическое разделение держателя и блока ручного
управления. Ряд коммерчески доступных микроманипуляторов обеспечивают
такие возможности; Leitz производит микроманипуляторы типа джойстик,
которыми можно управлять вручную либо-с помощью специальных приборов.
Гидравлический манипулятор Narishige МОЮ4 или 103М и пневматический
манипулятор серии De Fonbrune тоже очень удобны для микроинъекций.
- Устройство для вытягивания пипеток и микрокузница: для микроинъекций
необходима тонкая микропипетка с гладким кончиком; такие микропипетки
относительно легко можно изготовить с помощью коммерчески доступного
устройства и микрокузницы (Leitz; Narishige, PG-1, MF-77, Fonbrune,. MF-
80).
- Устройство для инъекций (например, Leitz) и тефлоновая трубка.
- Печь на 130°С.
Трансформация растительных клеток путем трансфекции ДНК
227
- Водяная баня на 40 °С.
- Стеклянные капилляры с внутренним диаметром 1,0-1,5 мм и наружным
диаметром 1,5-2,0 мм (например, Jencons) для изготовления микропипеток.
- Стеклянные капилляры для изготовления удерживающих пипеток (например,
Leitz 520-119).
- Контейнер для хранения микрокапилляров.
- Покровные стекла (22X22 мм).
- Найлоновые кольца (внутренний диаметр 10 мм, глубина 2 мм).
Растворы
- Этанол.
- Диэтнловый эфир (BDH Analar).
- Силиконирующий раствор (например, Sigma, Sigmacote).
- Поли-Ь-лизин (Sigma, мол. масса 80 000-130 000).
- Стерильная дистиллированная НгО.
- Протопласты (например, альбинотическая линия Petunia hybrida,
приложение 3[I]). Используют клетки, которые культивировали в течение 1-3
дней.
- Среда для культивирования протопластов (например, MSP1 9М, приложение
2[II]):
- Жидкая среда
- Среда с 0,5 и 1,0% (вес на объем) легкоплавкой агарозы (например,
Miles Scientific, Sea Plaque).
3.4.2.3. Методика
Приготовление микропипеток и заполнение их раствором для
инъекций
1. Перед вытягиванием замачивают стеклянные капилляры в этаноле на 1 ч
или в течение ночи, затем дают стечь остаткам спирта и высушивают при 130
°С в течение 30 мин. Для нанесения гидрофобного покрытия капилляры
погружают в смесь эфира и силиконирующего раствора (3:1), а затем
прогревают 1 ч при 130 °С. До использования хранят в стерильном, сухом и
закрытом контейнере.
¦2. Вводят и закрепляют стеклянный капилляр в устройство для вытягивания,
избегая контакта с нагревающей нитью. В зависимости от того, какие
микропипетки необходимы - диаметром 0,1-1 мкм для инъекций или 5-100 мкм
для удержания клеток, при использовании большинства фирменных приборов
следует регулировать следующие два параметра:
1) температуру нити, которая контролируется путем изменения силы
протекающего через нее электрического тока, и
228.
Глава 3
2) натяжения пружины, которое создается путем регулировки ручки
натяжения.
3. Просматривают вытянутую микропипетку под микроскопом. . для
определения диаметра кончика и общего качества,
4. Отполировывают микропипетку в пламени с помощью мик-рокузницыа).
5. Заполняют выбранные микропипетки раствором для инъекций. Для этого
опускают микропипетки в инъекционный: раствор и ждут, пока он не войдет в
пипетку под действием капиллярных сил, либо используют длинную трубку для
