Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
заполнения капилляров, как описано в литературе [39]б).
Методы иммобилизации клеток
Для проведения микроинъекций необходима иммобилизащш растительных
протопластов/клеток/органелл. Можно использовать различные методы, три из
них приведены ниже.
Метод, основанный на использовании поли-Ь-лизина [40]
1. Культивируют протопласты в соответствующей жидкой среде в течение 24
чв), а затем используют для иммобилизации, на покрытом поли-Ь-лизином
стеклянном покровном стекле-(рис. 3.7,Л).
2. Стерилизуют несколько стеклянных покровных стекол, помещая их на 24 ч
в абсолютный спирт, а затем тщательно ополаскивают стерильной
дистиллированной водой.
3. Помещают покровные стекла на 10 мин в стерилизованный" путем
фильтрования 0,1%-ный раствор поли-Ь-лизинав> (свежеприготовленный на
воде).
4. Удерживая покровные стекла пинцетом, осторожно ополаскивают их
стерильной дистиллированной водойг>. Промывают* покровные стекла средой
для культивирования протопластов. Избегают их высыхания.
5. Помещают покровные стекла в чашки Петри диаметром: 5 см. Наносят по
капле суспензии протопластов (100 мкл) на покровные стекла и оставляют на
30-60 мин, чтобы протопласты прикрепились к поли-Ь-лизину.
6. Отмывают неприкрепившиеся протопласты культуральной средой.
Метод вплавления в агарозу [23}. Свежеизолированные протопласты
иммобилизуют на твердой культуральной среде, в которую добавлена агароза.
1. Разводят протопласты жидкой средой для культивирования* (2хЮ4
протопластов в 1 мл).
2. Конструируют "камеру" для микроинъекций, используя стерильное
покровное стекло, поверх которого располагают
Трансформация растительных клеток путем трансфекции ДНК
229
стерильное найлоновое кольцо. Помещают камеру в пластиковую чашку
Петри диаметром 9 см. Практически полностью заполняют кольцо средой для
культивирования протопластов, содержащей 1% легкоплавкой агарозы, и дают
ей застытьд).
3. Смешивают каплю суспензии протопластов в культуральной среде при
комнатной температуре с равным объемом среды для культивирования
протопластов, 0,5% легкоплавкой агарозы, охлажденной до 40 °С. Для этого
помещают 1 мкл культуральной среды, содержащей 0,5% легкоплавкой агарозы,
в центр кольца, после этого добавляют 1 мкл протопластов в жидкой
культуральной среде и дают смеси застыть в течение 10 мин. Для
микроинъекций можно использовать протопласты, которые наполовину
погружены в агаризован-ную среду (рис. 3.7,Б).
Метод удерживающей пипетки [26, 5]. Удерживающие пипетки (внутренний
диаметр 5-10 мкм) вытягивают из стеклянных капиллярных трубок Leitz 520-
119 и полируют в пламени на микрокузнице. Можно использовать и пипетки со
сферическим кончиком (внешний диаметр 20-100 мкм) [5].
1. Соединяют удерживающую пипетку через тефлоновую трубку с микрошприцем.
С помощью микрошприца можно приложить к пипетке слабое отрицательное или
положительное давление, чтобы присосать или освободить протопласт.
2. Переносят протопласты, ресуспендированные в жидкой культуральной
среде, в пластиковую чашку Петри диаметром 5 см, расположенную на столике
микроскопа (в ламинарном боксе). Оставляют на 5 мин, чтобы протопласты
осели.
3. Наблюдая в микроскоп, удерживают отдельный протопласт путем легкого
присасывания и ориентируют (поочередно прикладывая и снимая давление)
таким образом, чтобы ядро/цитоплазма заняли благоприятное положение для
введения пипетки (рис. 3.7,В)е\
Техника микроинъекций
1. С помощью объектива ХЮ инвертированного микроскопа -сначала локализуют
подходящую клетку, иммобилизованную одним из описанных выше способов.
2. С помощью оптики Nomarski или флуоресцентного окрашивания ДНКе>
убеждаются, что ядро находится в таком положении, чтобы при инъекции не
была повреждена вакуоль. Если клетки или протопласты вплавлены в агарозу,
выбирают именно такую клетку. При использовании удерживающей пипетки
пытаются переориентировать клетку в правильное положение.
230
Глава 3
3. С помощью микроманипулятора располагают заполненный микрокапилляр
вблизи от выбранной клетки протопласта*). Находят ядро с помощью
объектива (Х40) и вводят микрокапилляр через ядерную мембрану3), стараясь
не повредить тонопласт.
4. Вводят известное количество раствора вектора в реципиент-ное ядрои>,
используя устройство для инъекции, и затем выводят микроиглу.
Примечания
а> Это единственный способ попрактиковаться в изготовлении микропинеток,
определяя затем их характеристики в процессе микроинъекций. в) Может
произойти высыхание образца па кончике, если заполненную микропипетку не
поместить в культуральную среду примерно на 1-2 мин. в) Свежевыделенные
протопласты часто погибают в результате воздействия полн-L-лизина.
Некоторые концентрации naM-L-лизина (они варьируют в зависимости от вида
растения) токсичны для протопластов возраста 24 ч. В каждом случае
необходимо тестировать влияние различных концентраций раствора поли-Ь-
лизина. г> Осторожное ополаскивание не вызывает удаления поли-Ь-лизина,
