Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
покрывающего стекло.
д) Агарозу перед употреблением охлаждают таким образом, что она почти
застывает.
е) Для визуализации ядра удобна дифференциальная интерференционная оптика
(Nomarski).
ж) Следует принимать предосторожности, чтобы быть уверенным, что кончик
не обломился в результате втыкания в дно чашки из-за неправильных
микроманипуляций или фокусирования. Появление отрицательного давления в
микропипетке приведет к всасыванию жидкости из окружающей культуральной
среды. В результате вместо раствора вектора произойдет инъекция
питательной среды в ядро, поэтому, если возможно, следует поддерживать
все время слабое положительное давление.
¦> Следует принять предосторожности, чтобы в процессе инъекции капилляр
не забивался материалом клеточной стенки нли цитоплазматическими
компонентами. Для наблюдения за инъекцией можно использовать
флуоресцентные красители, например Lucifer yellow. Часто можно наблюдать
разбухание ядер.
в) Для введения известного количества инъецируемого раствора в реципи-
ентное ядро тонкой капиллярной трубкой требуется четкая регуляция
давления внутри микропнпетки. Обычно используют стеклянный или
газонепроницаемый шприц на 1 мл (Hamilton), управляемый пружиной н
микрометром, соединенным с микропипеткой через клапан высокого давления и
тефлоновую трубку [1, 26].
Культивирование микроинъецированных протопластов
Микроинъецированные протопласты можно культивировать различными
способами. Полагают, что частота трансформации среди выживших клеток
довольно высока, поэтому основная проблема заключается в культивировании
небольшого количества клеток для обеспечения нормального образования
колоний и регенерации побегов.
Трансформация растительных клеток путем трансфекции ДНК
231
Культивирование в микрокаплях. Инъецированные клетки выращивают в висячих
микрокаплях в чашке Петри (рис. 3.8, ?). Инъецированные протопласты,
прикрепленные к покровному стеклу с помощью поли-Ь-лизина или вплавленные
в агарозу, осторожно удаляют, либо протопласты переносят непосредственно
в микрокапли после инъекции, используя удерживающую пипетку. Плотность
инъецированных клеток/протопластов в микрокаплях обычно составляет 104 в
1 мл культуральной среды. Объем капли, как правило, около 10-50 мкл, и,
следовательно, капля должна содержать 100-500 клеток. Провести
микроинъекции такого числа клеток трудно, поэтому используют фидерную
культуру неинъецированных протопластов (например, протопластов
суспензионной альбинотической культуры, если микроинъецировали
мезофильные протопласты, или наоборот), чтобы способствовать росту
инъецированных клеток. Обычно в каждую каплю помещают только 5 или 10
инъецированных клеток. Капли располагают рядами на крышке чашки Петри и
для поддержания высокой влажности на основание чашки Петри наносят
небольшие капли культуральной среды. При этом каждую микроинъецированную
клетку некоторых видов растений можно культивировать в отдельной
микрокапле, поэтому необходимость в селекции отпадает. Если используют
фидерные клетки, то образуемые ими .микроколонии должны заметно
отличаться от инъецированных клеток. В противном случае
трансформированные микроколонии необходимо селектировать с помощью
стандартных методов (разд. 2.9.3). Следует подчеркнуть, что для отдельных
видов растений разработка методов микрокультивирования может вызвать
значительные трудности.
Культивирование на покровном стекле. Целые покровные стекла с
микроинъецированными клетками можно аккуратно залить небольшим объемом
культуральной среды в чашке Петри. В этом случае росту инъецированных
клеток будут способствовать неинъецированные, впоследствии
трансформированные микроколонии необходимо отбирать на среде, содержащей
антибиотик (разд. 2.9.3). Во многих лабораториях проводят инъекцию
протопластов, иммобилизованных на специальном покровном стекле с
нанесенной сеткой, и следят за развитием инъецированных клеток с помощью
видеозаписи.
Фидерные культуры. Для инициации клеточного деления и формирования
микроколоний микроинъецированные протопласты можно выращивать на фидерной
культуре. Приведем один из многочисленных методов, который успешно
используется в ряде лабораторий. Фидерную культуру подготавливают,
помещая
232
Глава 3
найлоновое сетчатое кольцо диаметром 8 мм (размер ячеек сетки 15-20 мкм)
в центр чашки Петри диаметром 5 см (рис. 3.8,Л). Затем его фиксируют
путем заливки поддержи-вающего слоя - 2 мл среды для культивирования
протопластов, содержащей 0,8% (вес на объем) агара, распределяемой как
внутри, так и снаружи кольца. Затем на поверхность слоя агара наносят 2
мл среды для культивирования протопластов. Микроинъецированные
протопласты помещают в центре кольца, а соответствующие фидерные клетки -
вне его (рис.3.8, Л). Чашки обматывают пленкой Nescofilm и составляют в
темном помещении при 26 °С.
Более подробно культивирование протопластов и селекция скрининг
трансформированных колоний описаны в гл. 2.
