Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 106

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 100 101 102 103 104 105 < 106 > 107 108 109 110 111 112 .. 184 >> Следующая

организации и экспрессии генов на молекулярном уровне в
трансформированных растениях, В первом случае высокомолекулярная
очищенная ДНК и ин-тактяая РНК необходимы для получения соответственно
геномных библиотек и библиотек ДНК. Подробно методики клонирования генов
и их анализа описаны в других пособиях [1, 8]. После того как изучаемый
ген клонирован и его структура установлена, его можно ввести в растения
(в неизменном или модифицированном виде) с помощью векторов типа DMGT или
векторов, сконструированных на основе Ti-плазмид (гл. 1,2 и 3).
Кроме клонирования и конструирования генов методы выделения
нуклеиновых кислот и их анализа служат составной частью многих процедур,
используемых для определения структуры и экспрессии трансфицируемых генов
как в культурах трансформированных клеток растений, так и в целых
регенерированных растениях.
4.1.1. Выделение ДНК
В некоторых случаях для тестирования последовательностей чужеродного
гена в трансформированной ткани можно использовать метод дот-блоттинг-
гибридизации ДНК. Изучение организации чужеродной ДНК, встроенной в геном
растения, лучше всего начинать с блоттинг-гибридизации по Саузерну (гл.5
и разд. 6.2). Данный метод позволяет определить копийность встроенных
последовательностей ДНК, выяснить, расположены ли эти многочисленные
вставки тандемно либо рассеяны по геному, а также оценить стабильность
этой ДНК в поколении Fi трансформированных растений. Весьма важно
получить как можно больше данных о строении и расположении перенесенных
генов в геноме трансформированного растения, поскольку от этого в
значительной степени может зависеть их экспрессия и наследуемость. Для
подробного анализа организации чужеродной и окружающей ее ДНК требуются
такие методы выде-
Выбеление нуклеиновых кислот из клеток растений
237
ления ДНК, которые позволяют получить хорошо очищенные препараты с
достаточно длинными молекулами, что необходимо для клонирования генов.
Если для трансформации используют векторы, полученные на основе
агробактерий, важно выделять ДНК из стерильной ткани, поскольку
загрязнение ДНК A. tumefaciens может повлиять на интерпретацию
результатов.
Существенный фактор при выполнении ДНК из растительных клеток -
эффективное разрушение клеточных стенок. К сожалению, многие методы,
используемые для этого, приводят к фрагментации ДНК, и, следовательно, в
каждой конкретной ситуации достигается определенный компромисс между
размером ДНК и ее выходом. Эту трудность можно частично преодолеть при
использовании лиофилизированного материала (разд. 4.2). Однако
высвобождение высокомолекулярной ДНК - это только часть задачи, поскольку
экстракты растительных клеток содержат большие количества полисахаридов,
таннинов и пигментов, которые в ряде случаев весьма трудно отделить от
ДНК. Хуже того, некоторые полисахаридоподобные примеси невозможно
определить обычными аналитическими методами, не приводящими к разрушению
ДНК- Такие примеси препятствуют правильному определению количества
нуклеиновых кислот спектрофотометрическими методами и дают аномальную
кинетику гибридизации. Кроме того, что гораздо важнее, они могут
подавлять активность большинства ферментов, модифицирующих ДНК, в том
числе и ферментов рестрикции. Это может затруднять как анализ ДНК методом
блоттинг-гиб-ридизации по Саузерну, так и ее клонирование.
Клетки растений обычно разрушают в водных растворах в присутствии
хелатирующих агентов, подавляющих нуклеазную активность, и детергентов,
которые растворяют мембраны. После разрушения клеток белки денатурируют и
осаждают из экстракта, для чего часто используют фенол либо смесь
хлороформа с октанолом. Некоторые методики для освобождения ДНК от белков
хроматина предусматривают использование протеиназы (разд. 4.2.3.2). После
депротеинизации раствор ДНК все еще сильно загрязнен РНК и углеводами и,
следовательно, обычно подлежит дальнейшей очистке, техника которой в
определенной степени зависит как от количества использованной для
выделения ткани, так и от целей эксперимента.
Если требуется большое количество чистой ДНК, грубые экстракты ДНК
могут быть очищены дифференциальным центрифугированием в градиенте
плотности хлористого цезия, содержащего бромистый этидий (БЭ) (приложение
4 [II]). Затем для удаления солей ДНК подвергают диализу, осаждают из.
раствора и концентрируют с помощью этанола. На этой стадии удаляются и
многие низкомолекулярные примеси. ДНК, очи-
238
Глава 4
щенная в градиенте плотности, практически не содержит примесей РНК, и ее
концентрацию в растворе можно определить спектрофотометрически.
Кроме того, микрометоды (разд. 4.2.3.1 и 4.3.3.2) выделения тотальной
ДНК из трансформированных клеток растений позволяют получить
предварительные данные о ее организации. Для таких методов требуется
всего лишь 20 мг лиофилизиро-ванной либо 0,5 г свежей растительной ткани,
а очистка в градиенте плотности CsCl/БЭ не применяется. Выделенная ДНК
Предыдущая << 1 .. 100 101 102 103 104 105 < 106 > 107 108 109 110 111 112 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed