Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 109

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 103 104 105 106 107 108 < 109 > 110 111 112 113 114 115 .. 184 >> Следующая

пробирке 100 мкл однократного СТАВ-буфера для экстракции. Вновь
центрифугируют, удаляют водную фазу и соединяют ее с первой.
5. Добавляют 0,1 объема 10%-ного СТАВЖ) (70 мкл) к собранной водной фазе
и перемешивают. Повторяют экстракцию смесью хлороформ/октанол.
6. Стараясь не захватить клеточный дебрис, переносят водную фазу в
силиконированнуюи> центрифужную пробирку из пирекса (например, Corning
размером 16x125. мм) либо в устойчивую к хлороформу 3> пластмассовую
пробирку (например, полипропиленовую фирмы Sarstedt размером 16x95 мм).
Добавляют равный объем СТАВ-буфера для осажденияг) (600 мкл),
перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 минк).
Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений
243
7. Осаждают центрифугированием-") в настольной центрифуге с бакет-
ротором (2000 g, 15 мин). Удаляют супернатант и высушивают осадок. Если
осаждения не происходит, центрифугируют при больших скоростях в
силиконированных: пробирках из корекса (10 мин, 8000 g, 20 °С) в
центрифуге типа SorvalM>' н>.
8. Вновь растворяют осадок нуклеиновая кислота - СТАВ в 400 мкл NaCl,
при необходимости нагревая его до 56 °С. Переносят раствор в стерильную
пробирку Эппендорф.
9. После окончательного растворения осадка0" добавляют два объема (800
мкл) этанола, перемешивают и оставляют при -70°С (сухой лед/этанол) на 30
мин либо на ночь при -20 °С.
10. Осаждают выпавшие в осадок нуклеиновые кислоты в микроцентрифуге (2
мин) и промывают 1 мл 65%-ного этанола в течение 1 мин. Сливают этанол и
промывают осадок еще два разап>. Аналогичным образом промывают осадок
85%-ным этанолом. Если в какой-нибудь момент осадок взмутится, осаждают
его в микроцентрифуге.
11. Высушивают осадок в вакуумном эксикаторер) и вновь рас-творяютр>
нуклеиновые кислоты в 85 мкл стерильной дистиллированной воды. Хранят при
-20 °С.
12. Определяют концентрацию ДНКс) путем реакции с дифениламином (разд.
4.6).
Примечания
Если исследователь располагает большим количеством лиофилизированиой
ткани, целесообразно растереть ее и взвесить столько, сколько нужно для
выделения ДНК, учитывая вес добавленной окиси алюминия.
С) Эффективное разрушение клеточной стенки, вероятно, представляет собой
ключевой фактор успешного выделения ДНК, и в связи с этим необходимо
следить за тем, чтобы растирание проводилось тщательно. Респиратор
необходим для предотвращения вдыхания окиси алюминия, что может иметь
вредные последствия. Особенно важно удалить все водянистые ткани, которые
затрудняют растирание и в любом случае содержат мало ДНК. Механическая
гомогенизация, например, в кофемолке не столь эффективна, как в ступке,
однако может применяться в самом начале процедуры растирания. Можно
проконтролировать степень разрушения растительной ткани путем насыщения
образцов водой и исследования их под микроскопом для выявления
неразрушенных клеток. Неразрушенные ядра на любой стадии выделения
удается выявить, окрашивая препараты акридиновым оранжевым (приложение
2[VII],?). Метод, основанный на использовании СТАВ-буфера можно применять
и в работе со свежим растительным материалом (разд. 4.3.2.2), а также для
выделения ДНК из органелл (разд. 4.4.1.3).
г) СТАВ выпадает в осадок при температуре ниже 15 °С, поэтому буферы на
его основе следует хранить в теплом помещении. Типичная ошибка -
помещение пробирок, содержащих СТАВ-экстракты, в холодный ротор либо в
предварительно охлажденную центрифугу.
244
Глава 4
-*> Иногда после добавления СТАВ-буфера для экстракции к растертому
растительному материалу полученная суспензия отличается большой
вязкостью. Это зависит от источника ткани, содержания в ней полисахаридов
и т. д. Для удовлетворительной экстракции рекомендуется разводить
растертую ткань дополнительными аликвотами СТАВ-буфера, а затем
соответственно увеличить объемы растворов, используемых на последующих
стадиях.
•*) Во время инкубации при 56 °С окись алюминия начинает быстро оседать и
может увлечь за собой растительный материал. Поэтому важно время от
времени перемешивать экстракты, чтобы все мембраны растворились в СТАВ-
буфере.
ш> Смесь хлороформ/октанол используют для денатурации и осаждения белков.
Октанол добавляют для улучшения "смачивающих" свойств хлороформа, а также
в качестве поверхностно-активного вещества для предотвращения вспенивания
СТАВ. Вместо октанола можно использовать изоамиловый спирт, это зависит
от того, какой запах вам более неприятен! После экстракции органическими
растворителями и центрифугирования водная фаза должна быть прозрачной. В
противном случае необходимо центрифугировать либо в течение большего
промежутка времени, либо при больших скоростях. СТАВ растворим в
хлороформе, поэтому для поддержания требуемой концентрации добавляют 10%-
ный СТАВ. (10%-ный СТАВ очень вязкий, и перед использованием его
рекомендуется нагреть до 56°С).
;3> Важно отметить, что хлороформ растворяет многие пластмассы, и поэтому
Предыдущая << 1 .. 103 104 105 106 107 108 < 109 > 110 111 112 113 114 115 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed