Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
растворяют в соответствующем буфере или дистиллированной воде. Перед
дальнейшей работой проводят реакцию с дифениламином н определяют
концентрацию ДНК (разд. 4.6). ДНК в таких неочищенных препаратах обычно
полностью рестриктирована, и, следовательно, данный метод, применим
главным образом для быстрого анализа организации генов в
трансформированных тканях методом блоттинг-гибридизации по Саузерну. В
связи с тем, что средний размер ДНК в таких препаратах составляет около
25-50 т. п. н." метод мало пригоден для клонирования крупных фрагментов-
геномной ДНК. Примеси РНК, как правило, не препятствуют проведению
анализа, однако при необходимости их можно удалить РНКазой.
2. Если требуются более чистые препараты ДНК, то раствор-нуклеиновой
кислоты после повторного растворения можно очистить в градиенте плотности
CsCl/БЭ (приложение 4[П]). В разд. 4.2.3.1 приведен метод выделения
небольших количеств ДНК из лиофилизированных тканей, а процедура
крупномасштабного выделения описана в приложении 4[1]. Лишь при выделении
ДНК из некоторых лиофилизированных тканей (например, листьев злаков)
метод, основанный на использовании СТАВ, оказался не совсем удачным. В
разд. 4.2.3.2 приведен другой метод, основанный на обработке содержимого
клеток, разрушенных протеиназой в присутствии детергента (доде-
цилсульфата натрия, ДСН), и последующем концентрировании ДНК путем
осаждения спиртом. При этом обработка нуклеиновых кислот более мягкая, на
всех стадиях удается избежать их чрезмерной деградации, и, таким образом,
полученные препараты ДНК обладают довольно большой мол. массой (>100 т.
п. н.), что вполне подходит для клонирования генома..
Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений
241
4.2.2. Выделение небольших количеств ДНК
с помощью СТАВ-буфера
4.2.2.1. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1[1]).
- Пестики и ступки (диаметром 9 см).
- Окнсь алюминия (Sigma, тип 305).
- Одноразовые пластмассовые мешалки (Sarstedt).
- Водяная баня на 56 °С со штативом для микроцентрифуж-ных пробирок.
- Настольная центрифуга MSE Centaur 2 с бакет-роторош (или
аналогичная).
- Стерильные силиконированные центрифужные пробирки из пирекса (16x25
мм) с завинчивающимися крышками (Corning) или полипропиленовые пробирки
(например, Sarstedt," тип 60.540 (65X95 мм)).
- Штатив для центрифужных пробирок.
- Вытяжной шкаф.
- Стеклянный стакан для слива отходов (500 мл).
- Одноразовый респиратор (Robinson and Son, тип 68 000).
Растворы
- Однократный СТАВ-буфер для экстракции [50 мМ трис-HCl,. pH 8,0; 0,7 М
NaCl; 10 мМ ЭДТА; 1%-ный СТАВ (вес на объем), 20 мМ 2-меркаптоэтанол]. На
100 мл\
2,0 М трис-НС1, pH 8,0 2,5 мл
5,0 М NaCl 14,0 мл
0,5 М ЭДТА 2,0 мл
СТАВ (Sigma Н-5882) 1,0 г
2-Меркаптоэтанол (2-МЭ) 140,0 мкл
Раствор вначале следует приготовить без 2-МЭ, избегая пе-
нообразования, на подогреваемой мешалке, затем его автокла-вируют и
хранят при температуре выше 15 °С. Непосредственно перед использованием
добавляют соответствующую аликвоту 2-МЭ. В случае приготовления двух- и
трехкратных СТАВ-буферов для экстракции необходимы соответственно " два
или три раза большие концентрации составляющих компонентов.
Однократный СТАВ-буфер для осаждения [50 мМ трис-НС1, pH 8,0; 10 мМ
ЭДТА, 1%-ный (вес на объем) СТАВ].
На 100 мл:
2,0 М трис-НС1, pH 8,0 2,5 мл
0,5 М ЭДТА 2,0 мл
242
Глава 4
СТАВ 1,0 г
Готовят так же, как и СТАВ-буфер для экстракции.
- 10%-ный СТАВ ?10% (вес на объем) СТАВ, 0,7 М NaCl],
На 100 мл:
СТАВ 10,0 г
5,0 NaCl 14,0 мл
Примечание: все автоклавированные растворы, содержащие
СТАВ, стабильны при комнатной температуре (>15°С) в течение нескольких
месяцев.
- 1 М NaCl (стерильный).
- Стерильная дистиллированная вода.
- Смесь хлороформ/октанол (24:1) в обычном стеклянном
флаконе.
- Растворы спирта (100-, 85- и 65%-ный спирт).
4.2.2.2. Методика
1. Взвешивают 0,1 г лиофилизированного каллуса или 0,07 г
лиофилизированных листьев с удаленными главными жилками3'. Надев
респиратор, растирают ткань с 0,3 г окнси алюминия в небольшой ступке с
пестиком (диаметром
9 см) б>'в>.
2. Помещают растертую в порошок растительную ткань в пробирку Эппендорф.
Добавляют 600 мкл однократного СТАВ-буфера для экстракцииг) и осторожно
размешивают порошок пластмассовой мешалкойд). Инкубируют 10-20 мин при 56
°С. Время от времени необходимо постукивать по дну пробирки, чтобы
перемешивание проходило интенсивнее^.
3. Добавляют 600 мкл смеси хлороформ/октанол (24:1)ж)'3). и эмульгируют
встряхиванием. Центрифугируют 2 мин в микроцентрифуге и переносят водную
фазу (верхний слой) в чистую пробирку Эппендорф.
4. Промывают интерфазу, образованную денатурированным белком, в исходной
