Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
имеет достаточно большую мол. массу, однако сильно загрязнена РНК и в
меньшей степени полисахаридами. Концентрацию нуклеиновой кислоты в таких
неочищенных препаратах невозможно определить спектрофотометрически,
однако содержание ДНК может быть определено достаточно точно очень
чувствительным методом с использованием дифениламина (разд. 4.6).
Известны различные методы выделения ДНК из большинства органов
некоторых видов растений. В отдельных экспериментах по трансформации
может понадобиться анализ геномной ДНК (как ядерной, так и ДНК органелл)
для выявления перенесенных последовательностей. В данной главе описаны
методы выделения как небольших количеств нуклеиновых кислот, так и
процедуры их крупномасштабного выделения. Эти методики нашли широкое
применение для получения тотальной клеточной ДНК, а также ДНК из ядер и
органелл.
4.1.2. Выделение РНК
Обычно для изучения транскрипции перенесенных генов выделяют РНК, и
содержание в препаратах специфических тран-скриптов определяют путем
гибридизации с соответствующими меченными пробами (клонированными кДНК
или ядерными генами) методом дот-блоттинг-гибридизации (разд. 6.3). Метод
нозерн-блоттинга (приложение 6[I]) можно использовать для получения более
подробной информации о размерах определенного транскрипта.
Основная задача при выделении РНК-максимальное извлечение чистой
нуклеиновой кислоты при минимальной деградации. Методы выделения основаны
главным образом на подавлении рибонуклеазной активности и эффективном
разрушении комплексов РНК-белок. Опубликованы многочисленные методы
выделения РНК из различных растительных материалов; при этом используют
следующие реагенты:
- Фенол для денатурации белка.
- Концентрированные растворы солей (например, 4М гуани-
динхлорид) для одновременного растворения РНК и осаждения
денатурированных белков.
iВыделение нуклеиновых кислот из клеток растений
239
- Растворы протеиназ для разрушения белковых компонентов
комплекса РНК-белок.
Чаще всего используют фенол. В данной главе приведены две методики,
успешно применяемые для выделения нуклеиновых кислот из разнообразного
растительного материала. Выделенная с их помощью тотальная РНК обычно
содержит лишь 2-3% мРНК, остальную часть в препаратах составляют тРНК и
рРНК- За некоторыми исключениями, продукты транскрипции большинства генов
содержатся в зрелой poly А+-фракции мРНК (см. описание структуры мРНК в
разд. 6.2.2). В некоторых случаях достаточно выделения и анализа
тотальной РНК. Получение poly А+-мРНК (разд. 4.8) необходимо для синтеза
кДНК и проведения всех экспериментов, требующих высокой чувствительности.
В этой главе описаны некоторые основные методы выделения ДНК и РНК из
разнообразных растительных тканей. Данные методики использовались ранее,
однако необходимо подчеркнуть, что при работе с определенным растительным
материалом они могут потребовать некоторых изменений, и их следует
рассматривать лишь как общее руководство.
4.2. Выделение тотальной ДНК яз лиофилизированных тканей растений
4.2.1. Общие положения
Лиофилизацня весьма удобна для хранения растительного материала перед
выделением ДНК. В течение некоторого промежутка времени можно высушивать
и накапливать образцы растительного материала для последующего
одновременного выделения нуклеиновых кислот. Лиофилизированный
растительный материал можно хранить в течение нескольких лет, причем
качество получаемых из него препаратов ДНК со временем -снижается
незначительно. Высушенную ткань легко разрушить размалыванием или
растиранием. Лиофилизация позволяет сохранить целостность ДНК, поскольку
обезвоженная нуклеиновая кислота в меньшей степени подвержена распаду, а
нукле-азная деградация сведена к минимуму, так как гидратация происходит
в присутствии хелатирующих веществ и детергентов, подавляющих нуклеазную
активность.
Один из широко используемых методов [9] основан на том, что при
высоких концентрациях солей (0,7 М NaCl) нуклеиновые кислоты образуют
стабильные, но вместе с тем раствори-, мне комплексы с детергентом
цетилтриэтиламмоннй бромидом "{СТАВ, от англ. cetyl iriethylammonium
bromide). Снижение
240
Глава 4
концентрации соли ниже 0,4 М NaCl приводит к тому, что ком* плекс
СТАВ/нуклеиновая кислота выпадает в осадок, причем большая часть
полисахаридов остается в растворе. Осадок СТАВ/нуклеиновая кислота вновь
растворяют в концентрированном растворе соли (например, 1М NaCl). На этой
стадии можно выбрать один из двух путей дальнейшего проведения
эксперимента: 1) в неочищенном экстракте нуклеиновых кислот определить
содержание ДНК и затем использовать его непосредственно для анализа
методом блоттинг-гибридизации по Саузерну либо 2) очистить ДНК в
градиенте плотности CsCl/БЭ.
1. Из тотального препарата нуклеиновых кислот СТАВ удаля-. ют путем
осаждения этанолом (СТАВ растворим в этаноле,
а нуклеиновые кислоты нет). Промытый осадок нуклеиновых кислот
