Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
Х95 мм).
- Стерильный пластиковый одноразовый шприц на 60 мл.
- Стерильное найлоновое сито с ячейками размером 64 мкм (или
эквивалентное).
- Большой стерильный плоский сосуд из пирекса (Pyrex casserole dish -
Corning).
Растворы
(См. приложение 2 [II и V] -растворы для выделения протопластов и
культуральные среды.)
- Раствор для отмывания протопластов (например, CPW13M), 100 мл, Х2.
146
Глава 2
- Раствор ферментов для выделения протопластов, 20 мл, X2.
- Жидкая среда для культивирования протопластов (например, MSP1 9М для
табака), 100 мл, Х2.
- Агаризованная (0,8%) среда для культивирования протопластов
(например, MSP1 9М для табака) по 5 мл в чашках Петри диаметром 5 см, Хб.
2.7.3. Методика
1. Срезают почти полностью распустившиеся листья с растений табака
двухмесячного возраста.
2" Стерилизуют листья, погружая их на 20 мин в 10%-ный (вес на объем)
коммерческий отбеливатель (например, Domes-tos), а затем ополаскивают 5
раз в 400 мл стерильной водопроводной воды. Для стерилизации удобен
автоклавирован-ный сосуд из пирекса.
3. Дают листьям подсохнуть в потоке воздуха ламинарного бокса. Переносят
листья (нижним эпидермисом вверх) на стерильную белую кафельную плитку и
тонким пинцетом удаляют нижний эпидермиса>.
4. Оставляя центральные жилки, вырезают участки листовой пластинки (с
которых удален эпидермис) и подвергают клетки плазмолизу. Для этого
кусочки листа с незащищенным мезофиллом помещают на поверхность среды
CPW13M (30 мл), находящейся в чашке Петри диаметром 14 см. Постоянно
следя-т за тем, чтобы кусочки листа не высыхали.
5. Когда чашка будет полностью заполнена кусочками листьев, с помощью
стерильного шприца на 60 мл удаляют CPW13M и заменяют ее на 20 мл смеси
ферментов6). Инкубируют в темноте (25 °С, 16-18 ч).
6. Высвобождают протопласты из ткани путем осторожного перемешивания
расщепленных кусочков листа в чашке Петри с помощью пастеровской пипетки,
длинного пинцета или шпателя. Наклоняют чашку и удаляют большие агрегаты
дебриса из суспензии протопластов с помощью стерильного пинцета.
Пропускают суспензию через стерильное сито с отверстиями 64 мкм в другую
чашку Петри.
7. Стерильным шприцем на 60 мл переносят протопласты в центрифужную
пробирку с завинчивающейся крышкой. Центрифугируют при 400 об/мин (5 мин)
в центрифуге MSE Centaur 2 (или эквивалентной), чтобы осадить
протопласты.
8. С помощью пастеровской пипетки осторожно ресуспендируют осадок
протопластов в CPW13M. Переосаждают протопласты центрифугированием при
400 об/мин (5 мин).
9. Дважды отмывают протопласты путем осаждения и ресус-спендирования в
MSP1 9МВ>.
Трансформация клеток двудольных растений
147
10. Ресуспендируют протопласты в 5 мл (или другом подходящем объеме)
среды MSP1 9М и подсчитывают число жизнеспособных протопластов с помощью
гемоцитометраг). Мезо-фильные протопласты листьев табака показаны на рис.
2.14, А. Обратите внимание на фенотип жизнеспособных протопластов (рис.
2.14, Б)т\
11. Пластиковую чашку Петри диаметром 5 см заливают 5 мл
0,8%-ной агаризованной среды MSP1 9М. Затем на чашку высевают
протопласты в 2,5 мл жидкой MSP1 при концентрации около 1,5 X Ю5 живых
клеток в 1 мл. Конечная плотность высева составляет 5ХЮ4 клеток в Г мл.
12. Инкубируют (в темноте, 25°С) и ежедневно наблюдают за протопластами
(см. разд. 2.8).
Примечания
а) Удаление нижнего эпидермиса - это трудоемкая и требующая большого
мастерства процедура. Награда за терпение заключается в том, что
полученные при этом популяции протопластов, как правило, содержат высокий
процент жизнеспособных клеток. Описаны альтернативные способы быстрого
выделения протопластов, в которых используют мелко нарезанные кусочки
листа стерилизованных выращенных в теплице или размножаемых in vitro
растений. С одной из таких методик читатель может ознакомиться в
приложении 2 [VI]. Популяции протопластов, выделенных быстрыми методами,
обычно содержат много мертвых клеток и деб-рис, однако, тем не менее,
вполне пригодны для трансформации путем совместного культивирования с
агробактериями.
б) Эта смесь ферментов может быть использована только для выделения
мезофильных протопластов табака. Подходящий ферментный "коктейль" при
выделении протопластов из нового типа эксплантата, нового вида растения
или даже разновидности каждый раз приходится составлять заново. В целом,
изменение для растения условий роста предусматривает и изменение в смеси
ферментов, необходимой для хорошего выхода жизнеспособных протопластов,
способных к образованию клеточной стенки и делению.
в> Протопласты некоторых видов растений значительно повреждаются при
выделении; в этом случае целесообразно отделять интактные клетки от
разрушенных. При работе с Nicotiana tabacum можно ресуспендировать
протопласты в CPW21S (приложение 2[V]) и центрифугировать при 400 об/мин
в течение 10 мин. В результате центрифугирования интактные протопласты
формируют компактную зону на поверхности среды CPW21S, тогда как более
