Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
Однако, как мы уже упоминали в общем введении к данной главе, обнаружено,
что определенные типы эксплантатов регенерируют более легко, чем другие.
Чаще это гетерогенные эксплантаты, содержащие различные типы клеток,
некоторые из них могут реагировать на определенные среды непосредственным
формированием зачатков побега или даже эмбриогенезом либо давать начало
органогенному или эмбриогенному каллусу. Примеры гетерогенных
эксплантатов включают гипокотили, стебли проростков и черешки. Гомогенные
эксплантаты, такие, как семядоли, полоски эпидермиса и запасающая
паренхима, в норме содержат клетки одного или очень небольшого числа
типов и, таким образом, отличаются весьма устойчивой физиологией и имеют
тенденцию реагировать на воздействие среды для регенерации по принципу
"все или ничего", что часто затрудняет поиск правильной среды для
регенерации.
Трансформация через стадию каллуса будет описана на примере проростков
льна [10], однако с помощью сходной методики были трансформированы и
другие виды (приложение 2[VIII]). В предварительных экспериментах на
растениях льна комбинация эксплантатов гипокотиля размером 1-2 мм,
вырезанных из стерильных проростков двухдневного возраста, давала
наиболее воспроизводимую индукцию каллуса и регенерацию на среде MSD4X2.
К сожалению, при всех комбинациях эксплантатов и среды большинство
побегов возникает путем прямого формирования зародышей в глубоких
клеточных слоях ткани исходного эксплантата. В этом заключена основная
трудность, поскольку такие клетки не чувствительны к трансформации
агробактериями. Однако часто бывает так, что образовавшийся на
эксплантатах каллус, в котором происходит развитие большого числа
зачатков побегов, тоже способен к регенерации, особенно если он еще
прикреплен к первоначальному эксплантату. Такой каллус, предварительно
"заложенный" благодаря росту в местах поранения на регенерирующих
эксплантатах, может продолжать регенерировать после срезания и переноса
на све:жую среду для регенерации по крайней мере в продолжение одного или
двух пассажей. Способность такого каллуса регенерировать в селективных
условиях после удаления из ткани первоначального эксплантата сильно
уменьшает вероятность того, что какие-либо регенерирующие побеги могут
возникнуть путем непосредственного формирования зародыша без
дедифференциации клеток,
и, следовательно, более вероятно, что такие побеги трансформированы.
132
Глава 2
Изложенная ниже методика представляет собой простой путь получения
трансформированных растений льна, который исключает непосредственное
образование зародышей. В данном эксперименте сначала изучают способность
различных эксплантатов проростков льна регенерировать побеги. Затем
соответствующие эксплантаты инокулируют агробактериями и отбирают
трансформированные каллусы. И наконец, регенерируют побеги из
трансформированных тканей.
2.5.2. Получение стерильных проростков льна и регенерация из
эксплантатов проростков льна
2.5.2.1. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для культуры тканей (приложение
2[I]) -
- Стерильные банки емкостью 200 мл.
- Семена льна (Linum usitatissimum, сорт Antares).
- Эксплантаты (1-2 мм), взятые от двухдневных проростков льна: сегменты
гипокотиля, семядолей и кончиков корня.
Растворы
[Ростовые среды для растений (приложение 2[II]), антибиотики (приложение
2[III]).]i
- Стерильный вермикулит, смоченный раствором Хогланда, в сосудах
КилнераЧ
- Агаризованная среда для регенерации побегов [например, среда MSD4X2
(5 мл) в чашках Петри диаметром 5 см].
2.5.2.2. Методика
Выращивание стерильных проростков льна
Стерильные проростки представляют собой удобный источник растительного
материала для экспериментов по трансформации по следующим причинам:
- Не требуются сложные среды для размножения, и количество растений
лимитируется только наличием семян.
- Легко следить за стерильностью перед инокуляцией.
- Проростки содержат гетерогенную смесь легко экспланти-руемых
ювенильных тканей.
- Образование каллуса и регенерация побегов из материала проростков
эффективна у многих видов растений.
1. Стерилизуют семена в стерильной банке на 200 мл 10%-ным (вес на
объем) раствором коммерческого отбеливателя в те-
Трансформация клеток двудольных растений
133
чение 20 мин. Время от времени встряхивают, чтобы не допускать
прилипания семян друг к другу или к байке.
2. Тщательно ополаскивают 6 раз стерильной водопроводной водой. Удаляют
избыток воды и с помощью стерильного шпателя переносят семена в сосуд
Килнера, содержащий стерильный вермикулит, смоченный раствором ХогландаЧ
Равномерно распределяют семена по поверхности вермикулита с помощью
стерильного шпателя. Закрывают крышку банки и инкубируют (24-26
°С) при средней освещенности
(4000 люкс) с фотопериодом 16 ч.
Регенерация побегов из эксплантатов проростков
1. Через два дня после прорастания переносят проростки льна из стерильной
