Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
ростом резистентных к канамицину колоний1"), и оценивают частоту
трансформации.
Примечания
Плотность высева микроколоиий следует скорректировать в зависимости
от:
1) ростовых потребностей используемых видов растений;
2) среднего числа клеток в микроколониях (размера). Важио учесть, что
не все культуры клеток могут развиваться с одинаковой скоростью, и,
следовательно, время применения селективного давления будет варьировать у
разных видов, разновидностей и даже различных препаратов протопластов
одного и того же сорта;
Трансформация клеток двудольных растений
159
3) используемой среды. В некоторых случаях можно добиться успеха
при использовании среды, специально предназначенной для
культивирования микроколоний при низких плотностях высева (иапример, 103
колоний на чашку, см. [16], приложение 2 [И]);
4) необходимости достижения такой плотности высева, при которой ие
происходит перекрестного питания, или слишком тесного расположения
колоний в процессе подрастания трансформантов.
в) Концентрация используемого селективного агента (антибиотика или
гербицида) будет зависеть от размера микроколоний и плотности высева;
когда на чашках образуется небольшое число клеток, их первоначальная
жизнеспособность останется пониженной до тех пор, пока среда не
кондиционируется.
8) Если происходит массовый некроз микроколоний на селективных чашках при
всех плотностях высева, то альтернативный путь-это высевать микроколонии
с низкой плотностью на неселективной среде (рис. 2.16, В), а затем после
дальнейшего подращивания перенести случайно выбранные микроколонии на
селективные чашки (рис. 2.16,7') или идентифицировать трансформанты с
помощью процедур скрининга. Чтобы быть эффективной, эта альтернативная
технология "массовой селекции" требует достаточно высокой частоты
трансформации (около 1% или более).
г> Разработаны различные процедуры, облегчающие процесс селекции,
особенно перенос совместно культивированных клеток на селективную среду
(рис. 2.17), в том числе:
1) Использование фидерных культур и "переносных дисков", чтобы
обеспечить совместное культивирование при низких плотностях клеток и
создать твердую подложку колониям, которую легко можно переносить с одной
среды на другую, не нарушая расположение колоний [41]. Эта технология
используется при трансформации клеточных суспензий (разд. 2.10).
2) Метод культивирования в "агарозных каплях" [59] основан на
"вкраплении" совместно культивированных клеток с " низкой плотностью в
диски среды, застывшей благодаря добавлению агарозы; диски затем можно
переносить в жидкую среду, как содержащую, так и не содержащую
селективные агенты (рис. 2.16,5). Это позволяет легко менять среду. Диски
обычно аэрируют с помощью легкого покачивания чашки.
Регенерация растений табака из каллуса
1. Когда трансформированные колонии достигнут диаметра
1 см или более, переносят каждый каллус на среду для регенерации
(например, MSD4x2+Km для трансформированного каллуса табака3)) в
отдельные сосуды для роста (стандартные пробирки или чашки Петри
диаметром 5 см), чтобы индуцировать побеги6).
2. Инкубируют при 24-26 °С и освещенности 4000-5000 люкс в течение 2-4
нед и периодически наблюдают регенерацию побеговв)>г).
3. Регенерированные побеги можно размножить, укоренить и выращивать до
созревания, как описано в разд. 2.4.3.
Примечания
а) Среда MSD4X2 предназначена для регенерации целого ряда видов растений,
с которыми работают в Лестере, но не универсальна. Чтобы обеспечить
регенерацию побегов, может возникнуть необходимость ис-
160
Глава 2
ключения селективных агентов из состава среды. В этом случае
трансформированные растения впоследствии можно идентифицировать по
способности укореняться в присутствии антибиотиков или с помощью процедур
скрининга по экспрессии перенесенного гена (гл. 6).
6> Важно не субкультивировать трансформированные колонии в слишком
большом объеме среды, иначе им трудно будет прижиться. в> Отметим, что до
сих пор многие виды не удалось успешно регенерировать из материала,
полученного из протопластов. г> Повторный перенос на соответствующие
среды для регенерации, температурный шок и другие воздействия могут
способствовать регенерации из определенных тканей.
2.10. Трансформация клеток суспензионной культуры моркови
2.10.1. Основные положения
Неудачи в экспериментах по трансформации культурных видов растений,
как правило, обусловлены трудностями в их культивировании in vitro и не
связаны с неадекватностью векторной конструкции. Трансформация
протопластов имеет ограниченное применение, поскольку только немногие
экономически важные виды можно легко регенерировать из тканей, полученных
из протопластов. Однако у многих сельскохозяйственных растений возможна
регенерация из каллуса и клеток суспензионной культуры как путем
органогенеза [28], так и соматического эмбриогенеза [3]. Поэтому
предпринимаются большие усилия по разработке эффективных систем
