Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 72

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 66 67 68 69 70 71 < 72 > 73 74 75 76 77 78 .. 184 >> Следующая

трансформации для этих тотипотентных клеток культурных растений [5, 62,
65].
В настоящем разделе рассматривается трансформация эм-бриогенных
клеток суспензионной культуры моркови с помощью неонкогенного штамма
Agrobacterium [С58С1 (pGV3850 :: 1103)]. На рис. 2.18 схематически
изображены основные этапы данного процесса. Подходящей культурой моркови
может быть недавно установившаяся, высокоэмбриогенная клеточная
суспензия. Когда такие культуры поддерживают в среде, содержащей высокую
концентрацию ауксина (обычно 2,4-ди-хлорфеноксиуксусной кислоты, 2,4-
Д),они состоят из небольших колоний проэмбриогенной ткани (рис. 2.19,Л),
которые по существу представляют собой сложные эксплантаты. После
удаления ауксина клетки, из которых состоят эти колонии, с высокой
частотой вступают на путь соматического эмбриогенеза с образованием
большого числа соматических зародышей (3000 на 1 г ткани), которые могут
развиваться с образованием нормальных растений. Для совместного
культивирования с агробактериями проэмбриогенные клетки моркови из
суспензион-
Трансформация клеток двудольных растений
161
ной культуры высевают с низкой плотностью (250 клеток иа чашку) на
фидерный слой суспензионных клеток моркови, поскольку при данной
плотности они не способны к росту без посторонней помощи. В этих условиях
клетки моркови быстро растут, формируя видимые колонии диаметром 0,1-0,2
мм в течение 7-10 дней. На данной стадии растительную ткань ино-кулируют
A. tumefaciens и чашки инкубируют до 7 дней. После совместного
культивирования переносные диски помещают на
заллавленных Р среду
Б Культивирование в агарозе

OO^OOQ-O О О ° а ° °nOJ> ° о О *ОлОп О о а во в О_0 ООО
о ео°оо о° ео о о в?, о оОо°оо о о осго ft о отэ СГ0ОО°^О О ов
Протопласты/клетки заплавлнют в слой легкоплавкой агарозы в
небольших чашках Петри
с
D
Переносят агарозный диск и культивируют в жидкой
среде в чашке Петри при медленном вращении
Рис. 2.17. Методы культивирования и селекции трансформированных
растительных клеток.
селективную среду, которая содержит антибиотик (обычно цефотаксим) для
уничтожения агробактерий. Через 3-4 нед на чашках, инкубированных вместе
со штаммом A. tumefaciens, содержащим химерный ген устойчивости к
антибиотику, например nos-npt-ll, появляются резистентные колонии (рис.
2.19,5), тогда как клетки, инкубированные с контрольным штаммом
агробактерий, не способны к дальнейшей пролиферации (рис. 2.19,В).
162
Глава 2
Добавляют к фидерным клеткам суспензионную культуру
Переносят бумажный диск на селективную чашку
+ Кт
3-4 недели
Переносят Kmr -колонии в суспензионную культуру
3 недели
Инициация
эмбриогенеза
Зрелые растения
+ Km
Рис. 2.18. Техника трансформации суспензионных клеток моркови.
Рис. 2.19. Трансформация клеток суспензионной культуры моркови с помощью
агробактерий. А. Проэмбриогенные клетки суспензионной культуры, пригодные
для совместного культивирования. Б. Селекция резистентных к канамицину
колоний после совместного культивирования проэмбриогенной суспензии
клеток и штамма A. tumefaciens С58С1 (pGV3850:: 1103) и выращивания в
течение 2-3 нед на селективной среде (UM+200Сх+100 Km). В. Колонии
клеток, полученные, как описано выше ("?), за исключением того, что
совместное культивирование осуществляли со штаммом С5831 (pGV3850). Г-Ж.
Соматический эмбриогенез из суспензии резистентных к канамицину клеток,
индуцированных путем переноса на среду MSO, содержащую 100 мкг/мл
канамицина. Эмбрионы на глобулярной (Г), сердцевидной (Д), продолговатой
(?) и зрелой (Ж) стадиях роста. 3. Трансформированное растение,
перенесенное в почву. UM - среда Uchimiya и Murashige.
164
Глава 2
Для подсчета частоты трансформации можно сначала поместить переносные
диски на неселективную UM-среду (содержащую только цефотаксим) и
подождать, пока диаметр растущих микроколоний не составит 2-3 мм.
Отдельные колонии затем переносят на селективную среду, помещая по 100
колоний на одну чашку Петри диаметром 9 см, и вычисляют частоту
трансформации через 2-3 нед по количеству резистентных колоний. Диапазон
частот трансформации для моркови составляет 60-70% ,[65]. После
селекции трансформированный статус
резистентных колоний подтверждают путем тестирования экспрессии
диагностических маркерных генов. В случае С58С1 (pGV3850 : 1103)
резистентные колонии тестируют на активность неомицинфосфотрансферазы
(NPT-II) и присутствие нопалина (см. гл. 6). Убедившись в том, что
отобранные каллусы действительно трансформированы, их можно использовать
для регенерации устойчивых к канамицину растений. Для этого кусочки
каллусов переносят в жидкую среду UM, содержащую канамицин, чтобы снова
получить клеточные суспензии. Затем: может быть инициирован соматический
эмбриогенез путем тщательного отмывания клеток для удаления 2,4-Д и
высева на среду без ауксина (рис. 2,19, Г-Ж). Проэмбриогенные клетки в
Предыдущая << 1 .. 66 67 68 69 70 71 < 72 > 73 74 75 76 77 78 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed