Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
суспензии, у которых эмбриогенез обычно супрессирован высокой
концентрацией в UM-среде 2,4-Д, сначала становятся поляризованными путем
неравного деления, а затем проходят через нормальные стадии формирования
зародыша (глобулярную, рис. 2.19, Г, сердцевидную, рис. 2.19, Д, и
продолговатую, рис. 2.19,Е), образуя соматические эмбриоиды (рис. 2.19,
Ж). Весь процесс занимает около трех недель. Присутствие кана-мицина в
среде не оказывает неблагоприятного влияния на соматический эмбриогенез
резистентных к канамицину проэмбрионов моркови, однако в
противоположность этому нетранс-формированные клетки моркови не способны
вступать даже в очень ранние стадии эмбриогенеза на содержащей канамицин
среде. Эмбриоиды могут развиваться на MS-среде без гормонов, а при
достаточно большом размере их можно перенести в почву (рис. 2.19,3).
Ряд особенностей делают данный метод трансформации весьма удобным.
1. Для трансформации не нужно получать протопласты, что, конечно,
экономит много времени и усилий.
2. Все полученные до сих пор данные свидетельствуют, что
трансформированные колонии имеют клональное происхождение.
3. Частота трансформации относительно высока, поэтому в одном
эксперименте можно получить много независимых трансформантов.
Трансформация клеток двудольных растений
165
4. Трансформированные клетки являются эмбриогенными, способными легко
регенерировать растения.
Показано, что этот общий метод трансформации применим с небольшими
вариациями ко всем клеточным суспензиям двудольных растений,
тестированным к настоящему времени.
2.10.2. Инициация проэмбриогенных суспензионных клеточных культур
моркови, приготовление фидерных чашек и высев на переносные диски
2.10.2.1. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычные материалы для культуры тканей (приложение 2[1])-
- Стерильные диски из фильтровальной бумаги диаметром 5
и 8,5 см (Whatman № 1).
- Камера для подсчета колоний на 1 мл (тип Sedgewick Rafter).
- Инвертированный фазово-контрастный микроскоп Nikon Diaphot (или
эквивалентный).
- Семена моркови (например, Sutton Seeds Ltd, New Red Intermediate).
- Суспензия клеток моркови (через 10 дней после субкультивирования).
Растворы
Все ростовые среды для культур растительных клеток (приложение 2[П]).
- Агаризованная (0,8%) среда для проращивания стерильных семян; по 25
мл в чашках Петри диаметром 9 см (например, для моркови используют MSO).
- Агаризованная (0,8%) среда для индукции каллуса; по 25 мл в чашках
Петри диаметром 9 см (например, для моркови используют UM-среду).
- Среда для суспензионной культуры (например, для моркови используют
UM-среду).
- Агаризованная среда для суспензионной культуры (расплавленная и
выдерживаемая при 40 °С) для приготовления фидерных чашек (например, UM-
среда для моркови).
2.10.2.2. Методика
Инициация проэмбриогенных суспензионных культур моркови
Изложенная ниже методика позволяет получить проэмбрио-генную
суспензионную культуру из сегментов черешка проростков моркови. Хотя для
инициирования суспензионных клеточ-
166
Глава 2
ных культур других видов растений основные положения методики остаются в
силе, выбор эксплантата, сред и условий культивирования должен быть
изменен согласно [4]. Следует подчеркнуть, что растения моркови были
использованы только как пример для демонстрации трансформации и
регенерации путем эмбриогенеза. Данный метод трансформации одинаково
эффективен как при использовании суспензионных культур, которые
регенерируют путем органогенеза, так и культур, которые не являются
тотипотентными.
1. Поверхностно стерилизованные семена (10%-ный Domestos, 20 мин)
промывают стерильной водопроводной водой и проращивают на MSO-среде при
25°С под лампами дневного света с белым спектром (16-часовой день, 4000
люкс). Можно проращивать семена и в стерильном вермикулите, смоченном
раствором Хогланда (см. разд. 2.5, примечание а).
2. Срезают сегменты черешка (длиной 1 см) из проростков 7-дневного
возраста и помещают на UM-среду, содержащую
2 мг/л 2,4-Д, для индукции каллуса. Образование каллуса занимает
около 4 нед.
3. Стимулируют эмбриогенные суспензионные культуры путем переноса около
0,2 г каллуса моркови в 25 мл жидкой UM-среды в колбах Эрленмейера
(конических) на 100 мл. Инкубируют культуры при 25°С при круглосуточной
слабой освещенности (200-500 люкс) на качалке с круговым вращением (120
об/мин).
4. Субкультивируют каждые две недели путем переноса 15 мл культуры в 65
мл UM-среды в колбах Эрленмейера на 250 мл. В конце периода
субкультивирования в 1 мл культуральной суспензии содержится
приблизительно 1,ЗХЮ6 высевающихся единиц. Типичная проэмбриогенная
суспензионная клеточная культура показана на рис. 2.19,А. Обратите
внимание на маленькие, с плотной цитоплазмой, толстостенные клетки,
плотно упакованные в проэмбриогенные агрегаты. Неэмбриогенные клетки
гораздо больше по размеру и слабее связаны между собой. Суспензионные
