Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
предметное стекло и быстро (чтобы предотвратить высыхание) накрывают
покровным стеклом, которое с каждого угла поддерживается маленьким
кусочком пластилина. Для ранних культур важно поддерживать покровное
стекло, чтобы предохранить протопласты от разрушения, поскольку они не
полностью восстановили клеточную стенку.
Трансформация клеток двудольных растений
151
3. Окрашивают небольшие образцы протопластов, как описано в приложении
2[VII], и оценивают:
а) Средний процент выживаемости протопластов.
б) Среднюю эффективность высева (долю жизнеспособных клеток,
прошедших хотя бы одно клеточное деление).
в) Время проявления первых признаков формирования клеточной стенки.
г) Время первого клеточного деления.
д) Время первого цитокинеза.
е) Время второго деления.
4. Начинают совместное культивирование, когда клеточная популяция
становится компетентной для трансформации (разд. 2.9).
2.9. Трансформация протопластов путем совместного культивирования с
агробактериями
2.9.1. Основные положения
В процессе образования корончатого галла агробактерии способны
трансформировать клетки, прилежащие к поврежденной ткани, которые
претерпевают клеточные деления в ответ на поранение. Клетки интактного
растения, как правило, проявляют максимальный онкогенный ответ на
инфекцию A. tumefaciens между 1,5 и 3 днями после поранения. У различных
видов эта -"компетентная" фаза совпадает с первыми клеточными делениями в
ответ на поранение. Как было показано [50], раневой ответ можно
имитировать в культуре тканей, если превратить покоящиеся мезофильные
клетки листа или активно делящиеся клетки суспензионной культуры в
протопласты и индуцировать регенерацию клеточной стенки и клеточное
деление в соответствующей среде. В определенной фазе становления культуры
протопластов клетки компетентны для трансформации A. tumefaciens.
Технология совместного культивирования предусматривает инкубацию
протопластов в присутствии агробактерий в соответствующей жидкой
питательной среде и позволяет получать большое число трансформантов в
контролируемых условиях, Варьируя условия культивирования, плотность
высева и изменяя процедуру селекции, можно получить трансформированные
колонии клонального происхождения. Важно иметь в виду, что корончатые
галлы - это смесь нетрансформированных и различных типов независимо
трансформированных клеток и, следовательно, фенотип галла представляет
собой сумму фенотипов всех клеток, обнаруживаемых в опухоли. Однако
клеточная популяция трансформантов, полученных с помощью сов-
152
Глава 2
местного культивирования, однородна, и, таким образом, маскирующие
фенотипы не появляются. Это позволяет проводить селекцию и анализ
экспрессии генов без-значительных артефактов. Трансформированные колонии
можно отбирать на основе гормононезависимого роста, когда используют
олс+-векторы, или путем селекции на среде, содержащей антибиотики (когда
используют опс+- или опс~-векторы, имеющие доминантные селективные
маркеры, например гены резистентности к канами-цину).
Во введении к данной главе мы уже обсуждали различные этапы разработки
системы трансформации, использующей большие популяции малых эксплантатов,
таких, как полученные из протопластов клетки.
2.9.2. Обеспечение
Оборудование и приспособления
- Обычные материалы для культуры тканей (приложение 2[1]).
- Пластиковые чашки Петри диаметром 5 см, содержащие культуры клеток,
полученные из протопластов табака, как описано в разд. 2.7 и 2.8.
- Ночная культура штамма агробактерий несущего неонкоген-ный Ti-
плазмидный вектор с Ктг-геном [например, LBA4404 (pBin 19); разд. 1.3].
- Инвертированный микроскоп (например, Nicon Diaphot или эквивалентный).
- Настольная центрифуга с бакет-ротором, подходящим для центрифужных
пробирок, описанных ниже (например, MSE Centaur 2 или эквивалентная).
- Центрифужные пробирки (стерильные; Sarstedt, тип 55.468/001, 16X95
мм)х12.
- Штатив для центрифужных пробирок.
- Предметное стекло для подсчета колоний (тип Sedgwick-Rafter).
- Дощечки с названиями растений.
Растворы
Культуральные среды для растительных клеток (приложение 2[П]).
- Жидкая среда, содержащая бактериостатический антибиотик для удаления
агробактерий из клеточных культур после совместного культивирования, 100
мл [например, для протопластов табака, инкубированных с LBA4404(pBinl9),
используют MSP1 7М+СЬ (500 мкг/мл) ].
Трансформация клеток двудольных растений
153
- Агаризованная (0,8%) MSP1 7М+СЬ (500 мкг/мл); по 5 мл в чашках Петри
диаметром 5 см, Х4. Заметьте, что вместо СЬ для штаммов, отличающихся от
LBA4404(pBinl9), могут использоваться другие антибиотики.
- Агаризованная (0,8%) среда для высева микроколоний для
контролирования выживаемости после совместного культивирования с
агробактериями; 100 мл, расплавленная, при температуре 40°С [например,
для микроколоний табака ранее совместно культивированных с
LBA4404(pBinl9) используют MSPl + Cb (250 мкг/мл)].
