Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
- Агаризованная (0,8%) среда для селекции трансформированных
микроколоний; 100 мл, расплавленная, при температуре 40°С [например, для
Ктг-микроколоний табака используют MSPl + Cb (250 мкг/мл) + Km (100
мкг/мл)].
- Чашки с агаризованной селективной средой; по 12 мл в чашках Петри
диаметром 9 см, Х8 [например,'для Ктг-микро-колоний табака используют
MSPl + Cb (250 мкг/мл) + Km (100 мкг/мл) ].
- Агаризованная (0,8%) среда для роста трансформированного каллуса в
отсутствии селекции; по 12 мл в чашках Петри диаметром 9 см, Х8
[например, для каллуса табака используют MSPl + Cb (250 мкг/мл)].
- Среда для регенерации побегов из трансформированного каллуса; 25 мл в
чашках Петри диаметром 9 см, Х4 [например, для трансформированного
каллуса табака используют MSD4X2+Km (100 мкг/мл)].
2.9.3. Методика
Инокуляция полученных из протопластов клеток агробактериями
Клетки считаются компетентными для трансформации, когда в них
начинается репликация ДНК. Синтез ДНК во многих системах протопластов
начинается одновременно с регенерацией клеточной стенки во время первого
деления, но такие клетки, как правило, слишком слабые, чтобы пережить
совместное культивирование с агробактериями. Во многих случаях
целесообразно инокулировать культуры агробактериями, когда большинство
клеток в популяции вступает во второй период синтеза ДНК перед вторым
делением. В случае мезофильных протопластов табака, выделенных из
тепличных растений, эта стадия наступает через 6-8 дней культивирования.
1. Чтобы увидеть формирование клеточных пластинок, наблюдают за
развитием протопластов, окрашивая клетки тино-палом (разд. 2.8,
приложение 2[VII]). Когда 20-30% кле-
154
Глава 2
ток завершат первое деление, культура готова к инокуляции
агробактериями (рис. 2.14, Д-3).
2. С помощью стерильной пастеровской пипетки добавляют к протопластам
две капли ночной культуры штамма Agrobacterium LBA4404(pBinl9) в
соотношении около 100 бактерий на клетку. Обязательно ставят
неинокулированный контроль!
3. Обматывают края чашек лентой Nescofilm и инкубируют в темноте при 24-
26 °С в течение 36-48 ча).
Наблюдения, отмывание и удаление агробактерий
Во время совместного культивирования растительных клеток и бактерий,
как правило, образуется пленка растительных клеток, связанных с
бактериальными агрегатами (рис. 2.15)6). Последующие процедуры направлены
на осторожное разрушение этих агрегатов, чтобы наиболее эффективно
отобрать кло-нально полученные трансформанты и смыть как можно больше
контаминирующих агробактерий.
1. Наблюдают за совместным культивированием с помощью инвертированного
микроскопа.
2. Разъединяют слипшиеся растительные клетки путем осторожного
пипетирования. Переносят клетки из каждой чашки в отдельную центрифужную
пробирку с завинчивающейся крышкой. Открывают крышки и уравновешивают
пробирки раствором MSP1 7М. Осаждают клетки центрифугированием при 400
об/мин в течение 5 мин в настольной центрифуге (например, MSE Centaur 2).
3. Ресуспендируют осадок клеток в MSPI 7М, содержащей 1 мг/мл
карбенициллинав) (или другого соответствующего антибиотика в зависимости
от использованного штамма агробактерий), и снова центрифугируют.
4. Окончательно ресуспендируют клетки в 5 мл жидкой MSP1 7М, содержащей
соответствующие антибиотики (например,
1 мг/мл карбенициллина)(r)). Высевают клетки на чашку поверх 5 мл той же
самой агаризованной (0,8%) среды и инкубируютг).
5. Через 7-10 дней последующего роста клетки должны восстановиться после
совместного культивирования, и их переносят на среду MSPI ЗМ, содержащую
антибиотики, и инкубируют еще в течение недели до начала селекции.
Примечания
а) При необходимости продолжительность периода совместного
культивирования может быть увеличена при использовании более низких
температур (15 °С). Одновременно следует уменьшить плотность инокулята.
Трансформация клеток двудольных растений
155
в) Чрезмерное слипание растительных клеток может быть связано с
генотипом используемого штамма агробактерий или концентрацией либо
исходного инокулята, либо конечной бактериальной массы в культуральной
среде. Для уменьшения слипания можно принять следующие меры:
1) Взять штамм агробактерий с другим генотипом.
Рис. 2.15. Взаимодействие растительных клеток и агробактеряй при
совместном культивировании. А. В присутствии пораненных растительных
клеток агро-бакте*рии образуют большое число целлюлозных фибрилл, которые
вызывают соединение клеток. Б, Окрашивание специфичным для целлюлозы
красителем - тинопалом - ясно демонстрирует состав фибрилл. Прикрепление
агробактерий к поверхности растительной клетки, которое можно наблюдать с
помощью фазово-контрастного (Х1300, В) и сканирующего электронного
микроскопов
(X 15 ООО, Г).
2) Использовать инокулят меньшей плотности.
3) Сократить время совместного культивирования.
в' Режим обработки антибиотиками для удаления агробактерий из ткани
