Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
плотные разрушенные протопласты и дебрис осаждаются. Протопласты можно
отобрать пастеровской пипеткой и развести в MSP1 9М. Однако протопласты
многих растений чувствительны к высоким концентрациям сахарозы, а других-
имеют слишком высокую плотность, чтобы флотировать, и, таким образом,
дальнейшая их очистка невозможна.
г) Жизнеспособные протопласты имеют сферическую форму, а их хлоропла-сты
сохраняются в интактном виде (имеют овальную форму) и распределены в
цитоплазме равномерно (рис. 2.14,5). Нежизнеспособные протопласты часто
становятся несферическими и содержат бесформенные хлоропласта, собранные
в группу у одной стороны клетки (на рис. 2.14 отмечены стрелками).
Трансформация клеток двудольных растений
149
Таблица 2.2. Ключевые стадии развития протопластов
Цитологически различимые фазы, в которых находится Дни в культуре
большинство клеток
Расширение протопластов 1---2
Потеря сферической формы, указывающая на регене
рацию клеточной стенки 2---4
Миграция: хлоропласта более равномерно окружают
цитоплазму 2---6
Деление ядра 4---6
¦Формирование клеточной пластинки 5---8
Первое деление 6---10
Второе деление 8---12
-Формирование микроколоний 14---20
2.8. Культивирование мезофильных протопластов табака
2.8.1. Основные положения
Необходимо идентифицировать ключевые стадии в процессе развития
протопластов, чтобы, во-первых, определить, происходит ли нормальный рост
клеток в какой-либо популяции прото-лластов (рис. 2.14), и, во-вторых,
чтобы быть уверенным, что лгробактерии вводятся в культуру именно в тот
момент, когда растительные клетки приобрели компетентность.
Что касается первого требования, то можно следить за стадиями
(хронологический порядок которых приведен в табл.2.2) во время
становления культуры протопластов и подсчитать процент жизнеспособных
клеток на каждой стадии в любой клеточной популяции.
Увеличение размеров протопластов, миграция хлоропластов, первое и
второе деления и формирование колоний -все эти процессы можно наблюдать с
помощью фазово-контрастного мик-
Рис. 2.14. Развитие протопластов табака в жидкой культуре. А. Типичные
свежевыделенные мезофильные протопласты табака. Обратите внимание на
внешний вид поврежденных протопластов (отмечены стрелкой). Б.
Свежевыделенный и жизнеспособный протопласт при большем увеличении.
Хлоропласта равномерно распределены по его периферии. В. Протопласт,
окрашенный акридиновым оранжевым после деления ядра и непосредственно
перед делением клетки. Г. Дочерние клетки вскоре после деления. Д-3.
Внешний вид клеток, окрашенных тинопалом. Д. У протопластов в возрасте 5-
7 дней можно увидеть начало формирования клеточной пластинки. Е.
Завершение первого клеточного деления. Ж. Второе деление через 10 дней
культивирования. 3. Небольшая колония клеток через 14 дией
культивирования.
150
Глава 2
роскопа, часто с помощью инвертированного микроскопа, чтобы не открывать
чашки с культурами. Наблюдения за регенерацией клеточной стенки, делением
ядра и формированием клеточной пластинки можно проводить под
флуоресцентным микроскопом после окрашивания части клеток соответствующим
красителем (приложение 2[VII]). Такие красители избирательно связываются
с нуклеиновыми кислотами (рис. 2.14, В-Г) или новообразованным материалом
стенки (рис. 2.14, Д-3).
Наблюдение за цитологическими изменениями, происходящими в культуре,
позволяет предсказать тот момент, когда большая часть популяции вступит в
определенную фазу клеточного цикла. Например, во время первого клеточного
деления важно определить, когда большая часть популяции вступает в стадию
цитокинеза и S-фазу, и, следовательно, клетки становятся компетентными
для трансформации агробактериями.
2.8.2. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычные материалы для культуры тканей (приложение 2[1]).
- Инвертированный микроскоп Nicon Diaphot с флуоресцентной приставкой
(приложение 2[VII]).
- Предметные и покровные стекла для микроскопа.
- Пластилин.
Растворы
- Раствор акридинового оранжевого |
- Раствор тинопала | приложение 2[VIIJ.
- Раствор диацетата флуоресцеина J
2.8.3. Методика
1. Ежедневно наблюдают за культурой протопластов с помощью
инвертированного микроскопа. Оценивают процент протопластов, для которых
характерны определенные процессы (разд. 2.8.1), например образование
стенки, первое деление и т. д.
2. С помощью пастеровской пипетки отбирают небольшие образцы протопластов
из культур различного возраста. Помещают каплю (0,1-0,25 мл) культуры на
