Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 70

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 64 65 66 67 68 69 < 70 > 71 72 73 74 75 76 .. 184 >> Следующая

корончатых галлов (приложение 2(111]) можно использовать н для по-
156
Глава 2
давления роста агробактерий в экспериментах по совместному
культивированию. Однако иногда необходимо подобрать оптимальные
концентрации антибиотиков, поскольку системы протопластов часто более
чувствительны к ним, чем ткани корончатых галлов или косматого корня.
г) Если во время совместного культивирования происходит значительная
гибель клеток, то снова доводят плотность высева на чашки (приблизительно
до 5X104 клеток/мл).
Селекция трансформированных колоний
Колонии трансформированных растительных клеток можно отбирать или
путем высева на безгормональные среды в случае ояс+-векторов, или путем
высева на среды, содержащие в норме высокие концентрации токсичных
антибиотиков, если в опс~-векторы включены доминантные селективные
маркерные гены (например, резистентности к канамицину). Известно
несколько важных моментов, касающихся условий селекции.
Во-первых, микроколонии должны иметь достаточный размер, чтобы их
можно было высевать при низких плотностях. Например, полученные из
протопластов микроколонии табака трехмесячного возраста, изображенные на
рис. 2.16,А, находятся на подходящей стадии для начала селекции. При
слишком высокой плотности колонии прорастают друг в друга, что затрудняет
получение клонального материала, а также создает проблемы нз-за
перекрестного питания.
Во-вторых, условия селекции должны быть такими, чтобы массовый некроз
нетрансформированного материала не ингибировал рост трансформированных
колоний. Таким образом, может быть целесообразна первичная селекция на
средах, содержащих пороговые ингибирующие концентрации антибиотиков, в
особенности если протопласты не отличаются высокой жизнеспособностью.
Предполагаемые трансформанты можно отобрать и перенести на среды,
содержащие оптимальные концентрации селективного агента.
В-третьих, собственная устойчивость колонии растительных клеток к
токсичным антибиотикам с увеличением размера (возраста) колонии, как
правило, повышается.
Приведенные выше соображения в равной степени относятся к выделению
трансформантов из клеточных суспензий, совместно культивированных с
Agrobacterium tumefaciens (разд. 2.10), и популяций протопластов,
трансформированных путем прямого поглощения векторной ДНК (гл. 3).
Описанные методы можно применять для селекции трансформированных колоний
во всех экспериментах, подразумевающих использование больших популяций
малых гомогенных эксплантатов.
1. С помощью пастеровской пипетки переносят микроколонии в стерильные
центрифужные пробирки и осаждают (400 об/ /мин, 2 мин) или дают колониям
отстояться.
ft *
%
Рис. 2.16. Селекция трансформированных колоний табака. А. Полученные из
протопластчв микроколонии трехнедельного возраста на стадии, удобной для
селекции. Б. Селекция трансформантов путей культивирования в агарозной
капле. Можно использовать и двухстадийный метод. В. Селекция
трансформантов путем вплавления микроколоний в неселективную среду; из
микроколоний сначала выращивают макроколонии размером 2-3 мм. Затем
вручную переносят макроколонии на селективную среду. Г. Показан
интенсивный рост трансформантов через 2-3 нед.
158
Глава 2
2. Отмывают микроколонии культуральной средой (например, MSP1 для табака)
и ресуспендируют в. 10 мл (или любом другом подходящем объеме) среды.
3. Посчитывают число колоний в 1 мл с помощью предметного стекла для
подсчета колоний. Стараются взять репрезентативные образцы, поддерживая
равномерное распределение клеток в суспензии.
4. Заливают колонии (500 колоний на 1 мла>) в 10 мл агаризо-ванной среды
для селекции трансформантов [например, для табака используют MSPl+Km (100
мкг/мл)+СЬ (250 мкг/ /мл)]б> в чашке Петри диаметром 9 см. Высевают и
некоторое количество микроколоний в той же среде, но без селективного
агента [например, MSPl + Cb (250 мкг/мл)] для контроля выживаемости.
Высев на чашки осуществляют одним из двух способов:
а) Готовят необходимое число микроколоний для одной чашки Петри
диаметром 9 см (5000 колоний) в теплой (37 °С) центрифужной пробирке:
Удаляют среду, заменяют на 8 мл расплавленной селективной среды (40°С),
встряхивают круговым движением для перемешивания и немедленно выливают на
поверхность селективной чашки.
б) Дают микроколониям осесть в центрифужной пробирке, а затем удаляют
большую часть супернатанта. Решают, на сколько селективных чашек
распределить микроколонии из эксперимента по совместному культивированию.
Распределяют микроколонии в капельках по необходимому числу чашек. Быстро
добавляют 7 мл селективной среды (например, MSPl + Cb + Kjn; 40 °С), а
затем, прижимая дно чашки Петри к рабочей поверхности ламинарного бокса,
покачивают чашку из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить
колонии, пока среда не застынет.
5. Обматывают края чашки лентой Nescofilm, а затем инкубируют на свету
(4000-5000 люкс) при 24-28°СЧ Культивируют в течение 3-6 нед, наблюдая за
Предыдущая << 1 .. 64 65 66 67 68 69 < 70 > 71 72 73 74 75 76 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed