Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
6) и использовать как исходный материал для соматического эмбриогенеза.
Соматический эмбриогенез в присутствии канамицина
1. Наиболее удобно инициировать соматический эмбриогенез в суспензионных
культурах, так что необходимо сначала получить их из каллуса,
образовавшегося из отдельных трансформированных колоний (разд. 2.10.2.2).
2. Для получения однородной популяции зародышей 40 мл суспензии
приблизительно 10-дневного возраста фильтруют через сито с диаметром пор
200 мкм, а затем через сито с диаметром пор 80 мкм.
3. Центрифугируют и объединяют фильтраты в одну стерильную стандартную
пробирку. Тщательно промывают суспензию жидкой MSO-fO,5 мкМ абсцизовой
кислоты (АБК) путем повторного (по крайней мере дважды) центрифугирования
и ресуспендированияд).
4. Ресуспендируют фильтрат в конечном объеме 10 мл MSO+ + АБК и высевают
на поверхность 20 мл агаризованной MSO среды в чашке Петри диаметром 9
см.
5. Обматывают края чашки и инкубируют в темноте при 25°С. Эмбрионы должны
появиться в течение 10 дней и достичь нормального размера через 2-3 нед
(рис. 2.19, Г-Ж).
6. Для прорастания зародыши необходимо поместить на твердую среду MSO без
АБК и выдерживать на свету; через 15 дней из них разовьются растеньица.
7. Для дальнейшего роста растеньица можно перенести непосредственно в
компост (например, Levingtons), если выдерживать их во влажной среде 3-5
дней (рис. 2.19,3). Следует избегать излишней сырости, поскольку
растеньица склонны к "выпреванию"е>.
Примечания
а Кружки фильтровальной бумаги Whatman диаметром 9 см слишком велики для
чашек Петри того же диаметра!
170
Глава 2
б> Число агробактерий, используемых для инокуляции, должно составлять
около 1000 бактерий иа чашку. Поскольку различные штаммы агробактерий
растут с различной скоростью, важно перед началом экспериментов
определить концентрацию бактерий в ночной (12-часовой) культуре,
используемой для инокуляции. Это можно сделать путем выращивания бактерий
в стандартных условиях и высевая на чашки с твердой агаризованной
питательной средой определенные разведения культуры (10-3-10~4).
Соответствующие коэффициенты разведений можно затем определить по числу
появившихся колоний, чтобы получить приблизительно 1000 бактерий в 200
мкл разведенной суспензии. в> Различные штаммы агробактерий различаются
по скорости роста на засеянных переносных дисках, так что невозможно
назвать определенное время инкубации для этапа совместного
культивирования. Поэтому для оптимизации данного этапа необходимо
проделать некоторую предварительную работу. Совместное культивирование
должно продолжаться как минимум 5 дней и, если возможно, до 10 дней. В
конце периода совместного культивирования бактерии должны быть видны на
поверхности переносного диска в виде отдельных колоний. Нельзя допускать,
чтобы отдельные колонии бактерий слились в сплошной газон, поскольку в
этом случае растительные клетки не восстановятся при переносе на
селективные чашки. Необходимо найти равновесие между длительностью
периода совместного культивирования и снижением жизнеспособности
растительных клеток, которое этим вызывается. г> а) - это контроль
селекции, подтверждающий, что колонии, полученные из клеток,
инокулированных С58С1 (pGV3850), не растут на среде с ка-намицином в
данных условиях; б) и г) -это контроли выживаемости, чтобы проверить, что
обработка агробактериями и цефотакси-мом не вызывает гибели высеваемых
клеток, а в)-селективная чашка для трансформированных (Kmr) колоний. д>
Это важно, поскольку UM-среда содержит в высокой концентрации 2,4-Д,
который оказывает сильное ингибирующее влияние на эмбриогенез. АБК
способствует нормальному течению эмбриогенеза и ингибирует
преждевременное созревание, в частности растяжение корня.
е) Общие указания по укоренению культивируемых растений в компосте см. в
разд. 2.4.3.
Приложение 2 [I]
Обычные материалы для работы с культурой тканей
А. Общее оборудование
- Скальпель (с длинной и короткой ручкой).
- Шпатель (длинный).
- Пинцет (длинный и средний).
- Часовой пинцет.
- Ламинар (John Bass Ltd. или Slee Medical Ltd.).
- Горелка Бунзена и спички.
- Найлоновые мешки для автоклавирования.
- Одноразовая маска для лица.
- Nescofilm (Sigma).
- Небольшой пластиковый сосуд для мытья посуды.
- Проволочный штатив для стандартных пробирок.
Трансформация клеток двудольных растений
171
- Мерные цилиндры на 100 и 1000 мл.
- Резиновые груши для пастеровских пипеток.
- Стакан на 500 мл для отходов.
Б. Стерильное оборудование
- Белые кафельные плитки.
- Пастеровские пипетки.
- Пластиковые чашки Петри диаметром 5, 9 и 14 см (Sterilin Ltd.).
- Пластиковые стандартные пробирки (Sterilin Ltd.).
- Контейнеры для выращивания растений Phytocon (Flow Laboratories Ltd.).
- Конические колбы Эрленмейера из пирекса на 100 и 250 мл.
- Алюминиевая фольга.
- Сосуды на 200 мл.
В. Растворы -Этиловый спирт.
- Domestos (Lever Brothers Ltd. или раствор аналогичного
