Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
культуры можно использовать в экспериментах по трансформации через 8-10
нед после инициации.
Приготовление фидерных чашек
1. Выливают 20 мл суспензионной культуры в стерильную пластиковую
стандартную пробирку на 25 мл и дают крупным клеточным колониям осесть в
течение 5 мин. Небольшие колонии будут осаждаться последними и
использоваться для приготовления фидерной чашки.
2. С помощью пастеровской пипетки переносят около 2 мл тонкой суспензии в
чашку Петри диаметром 9 см и заливают
Трансформация клеток двудольных растений
167
15 мл UM-среды (40°С) из градуированной пластиковой пробирки.
Размешивают клеточную суспензию путем покачивания чашки легким круговым
движением и дают застыть в течение 15 мин.
3. Помещают на поверхность твердого агара "предохраняющий" диск
стерильной фильтровальной бумаги диаметром 8,5 сма>, а поверх него -
стерильный диск диаметром 5 см ("переносной"). Если диски остались
сухими, то-их можно
¦смочить небольшим количеством жидкой UM-среды.
4. Инкубируют фидерные чашки 3-4 дня.
"Засев" переносных дисков
1. Выливают 20 мл клеточной суспензии моркови в стерильную пластиковую
пробирку и дают отстояться большим колониям клеток в течение 5 мин.
2. Пастеровской пипеткой переносят супернатант в чистую стандартную
пробирку. Для высева на переносной диск будут использоваться маленькие
агрегаты клеток и отдельные клетки.
3. С помощью пипетки 1 мл супернатанта вносят в камеру для счета и
определяют число клеточных колоний в 1 мл. '
4. Доводят концентрацию высеваемых клеток до 500 колониеобразующих единиц
на 1 мл, разводя их жидкой UM-средой или концентрируя путем
центрифугирования.
5. С помощью микропипетки Gilson Р1 ООО высевают на каждый переносной
диск 250 колониеобразующих единиц, стараясь покрыть максимальную площадь
переносного диска.
2.10.3. Инокуляция клеток моркови агробактериями, селекция
трансформантов и регенерация путем
соматического эмбриогенеза
2.10.3.1. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычные материалы для культуры тканей (приложение 2[1] )•
- Найлоновые сита (стерильные) с отверстиями 200 и 80 мкм.
- Стерильные универсальные пробирки.
- Ночные культуры (разд. 1.3) штамма агробактерий, несущего неонкогенную
Ti-плазмиду с селективным маркерным геном, и контрольного штамма, не
несущего маркерного гена (например, С58С1 (pGV3850 :: 11030) и С58С1
(pGV3850), гл.1).
168
Глава 2
Растворы
[Культуральные среды для растительных клеток (приложение 2[П]).
- Среда для суспензионной клеточной культуры (например, UM для моркови).
- Селективные и контрольные чашки; по 25 мл среды на чашку диаметром 9
см. Например:
UM+Km (100 мкг/мл) +Сх (250 мкг/мл)
UM+Cx (250 мкг/мл).
- Среда для суспензионных культур с селективным агентом [например, для
Ктг-клеток моркови UM + Km (100 мкг/мл)].
- Среда для суспензионных культур, используемая для отмывания
трансформированных клеток перед индукцией эмбриогенеза (например, в
случае Ктг-трансформированных клеток моркови -используют MSO+0,5 мкМ
абсцизовой кислоты).
- Агаризованная (0,8%) среда для индукции эмбриогенеза; по 20 мл в
чашках Петри диаметром 9 см [для трансформированных клеток моркови
используют MSO+Km (100 мкг/ /мл)].
2.10.3.2. Методика
Инокуляция клеток моркови агробактериями
1. Берут ночные культуры (разд. 1.3) штаммов Agrobacterium С58С1
(pGV3850:: 1103) и С58С1 (pGV3850) и готовят разведения каждой (1: 1000)
в жидкой UM-среде (10 мкл культуры в 10 мл)б>.
2. С помощью микроиипетки Gilson Р200 в каждую чашку вносят по 200 мкл
разведенных агробактерий в виде нескольких капель. Инокулируют по крайней
мере три чашки штаммом С58С1 (pGV3850) и три чашки - С58С1 (pGV3850 ::
1103).
3. Обматывают края чашек лентой Nescofilm и инкубируют в течение 4-8 дней
или до появления колоний агробактерий на поверхности фильтровальной
бумаги(r)).
Селекция трансформантов
1. Помещают переносные диски на селективные/контрольные чашки (с помощью
стерилизованного в пламени горелки пинцета) для получения следующих
комбинацийг).
а) С58С1 (pGV3850) на UM+Km (100 мкг/мл)+Сх (250 мкг/мл)
б) С58С1 (pGV3850) на UM+Cx (250 мкг/мл)
в) С58С1 (pGV3850:: 1103) на UM+Km (100 мкг/мл)+Сх (250 мкг/мл)
г) C58Cl(pGV3850:: 1103) на UM+Cx (250 мкг/мл).
Трансформация клеток двудольных растений
169
2. Обматывают края чашек лентой Nescofilm, инкубируют при 25°С (2000-4000
люкс) и постоянно наблюдают за ними.
3. Через 15-20 дней на селективных чашках, содержащих клетки,
инокулированные С58С1 (pGV3850: 1103), должны появиться резистентные к
канамицину колонии (рис. 2.19,5), тогда как колонии, полученные из
клеток, инокулированных С58С1 (pGV3850), должны расти только на средах,
не содержащих канамицина. Просматривают все чашки и оценивают частоту
трансформации.
4. Когда диаметр колоний достигнет 0,5-1,5 см, их можно перенести на
свежую селективную среду (UM+Cx+Km) для дальнейшего роста и анализа (гл.
