Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
культуры и помещают в стерильную чашку Петри диаметром 9 см.
г;
t t
¦ ¦
\ - О;. *
¦,>V- '¦%¦¦¦ ¦
if
Рис. 2.10. Влияние происхождения эксплантата на регенерационную
способность эксплантатов проростков льна. Различные эксплантаты после
четырех
недель культивирования на MSD4X2: А - корни, Б - гипокотили, В -
семядоли.
2. Нарезают эксплантаты гипокотиля, семядолей и корня длиной 1-2 мм и
помещают по 15-20 эксплантатов каждого типа на среду MSD4X2. Инкубируют
на свету (3000- 4000 люкс) при 24-26 °С.
3. Регулярно наблюдают за образованием каллуса и органогенезом на
эксплантатах, обращая особое внимание на локализацию и стадию развития
любых регенерирующих побегов.
4. На рис. 2.10 показан ответ различных эксплантатов льна при выращивании
на среде для регенерации MSD4X2. Ясно, что срезы гипокотиля легче всего
дают регенерацию побегов.
5. Более детально развитие побегов из гипокотилей льна иллюстрирует рис.
2.11, А-В. Заметим, что в приведенном эксперименте эксплантаты были
инокулированы штаммом агро-
134
Глава 2
бактерий, и поэтому среда содержит цефотаксим, который не оказывает
неблагоприятного влияния на реакцию регенерации. Через три недели
эксплантаты образовали каллус по краям среза гипокотиля и произошла
регенерация нескольких локализованных побегов (рис. 2.11,Л). Через шесть
недель эксплантаты покрылись побегами на различных стадиях развития (рис.
2.11,Б). Гистологический анализ показал, что эти побеги развиваются путем
прямого формирования зародышей из слоя клеток внутри или вблизи
сосудистых тканей.
*
¦ --\1 .V.
Шт
*¦
Д
Рис. 2.11. Трансформация гипокотилей льна штаммом A. tumefaciens С58С1
(pGV3850:: 1103). Внешний вид срезов гипокотиля через, три (А) и через
шесть недель культивирования на среде MSD4X2+200 Cx (Б). В. При
увеличении эксплантата (стадия, показанная на фотографии Б) можно увидеть
возникновение зародышей побегов. Г-Е. Формирование побегов из гипокотилей
льна, ииокулированных С58С1 (pGV3850:: 1103) и инкубируемых на
селективной среде MSD4X2+200 Сх+100 Km (соответственно через 2, 4 и 6
нед).
Итак, образование каллуса можно индуцировать по краям среза
гипокотиля льна, и бактериостатический агент цефотаксим не влияет на
нормальное развитие каллуса, следовательно, эти участки клеточного
деления на эксплантатах гипокотиля льна представляют собой источник
компетентных клеток для трансформации агробактериями. Цефотаксим мало
влияет и на
Трансформация клеток двудольных растений
135
регенерацию побегов. Однако большинство побегов, образующихся на таких
эксплантатах, получены из тканей, нечувствительных к агробактериям.
2.5.3. Трансформация гипокотилей, регенерация из трансформированного
каллуса, селекция, размножение и ускорение трансформированных побегов
2.5.3.1 Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для культуры тканей (приложение
2[П]).
- Стерильные проростки льна двухдневного возраста в сосудах Килнера на
вермикулите, смоченном раствором Хоглан-да (разд. 2.5.2.2 и приложение
2[VI]).
- Ночная культура (разд. 1.3) неонкогенного штамма агробактерий с
селективным маркерным геном [например, С58С1 (pGV3850 :: 1103) содержит
ген nos-npt-II, который сообщает трансформированным растительным клеткам
устойчивость к канамицину].
Растворы
Ростовые среды для растений (приложение 2[11]), антибиотики
(приложение 2[Ш]).
- Жидкая среда MSD4X2 для разведения культуры агробактерий.
- Агаризованная среда для совместного культивирования (например,
MSD4X2) и та же среда, содержащая бактериоста-тический антибиотик
(например, Сх) и/или селективный агент (например, Km) для подавления
роста агробактерий и отбора трансформированных каллусов. Например:
MSD4X2; по 25 мл в чашках Петри диаметром 9 см(х4). MSD4X2+Cx (200
мкг/мл); по 5 мл в чашках Петри диаметром 5 см (X 10).
MSD4x2+Cx (200 мкг/мл) +Кт (100 мкг/мл); то же ХЮ. MSD4x2+Km (100
мкг/мл); то же х4.
- Среда для роста и дальнейшей селекции срезанных Ктг-каллусов
[например, MSD4x2+Cx (200 мкг/мл) + + Кт (10 мкг/мл); по 5 мл в десяти
чашках Петри диаметром 5 см].
- Среда для размножения трансформированных растений [например, MSFLAX +
Cx (200 мкг/мл) + Km (100 мкг/мл); по 40 мл в банках на 200 мл].
136
Глава 2
- Среда для укоренения трансформированных растений [например, 95-кратная
среда B5+Kjn(100 мкг/мл); по 40 мл в банках на 200 мл или по 60 мл в
сосудах Platcons].
2.5.3.2. Методика Трансформация
1. Подготавливают следующие чашки для инокуляции агробактериями:
Серия А: Две чашки диаметром 9 см, содержащие по 20 мл разведенной в
50 раз ночной культуры агробактерий С58С1 (pGV3850 :: 1103) в MSD4X2.
Рис. 2.12. Разрезание прооростков льна для получения эксплантатов
гнпокотн-ля, которые трансформируют с помощью агробактернй.
Серия Б: две чашки диаметром 9 см, содержащие по 20 мл MSD4X2
(контроль).
2. Соблюдая стерильность, удаляют двухдневные проростки из сосудов
