Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
методы, разработанные для бактерий. Эта технология часто упоминается как
метод совместного культивирования и включает инкубацию агробактерий
совместно с многочисленными попу-
Трансформация клеток двудольных растений
141
ляциями дедифференцированных растительных клеток в питательной среде
часто в течение нескольких дней. Подобные системы имеют практическое
значение при необходимости получения большого числа трансформантов. Кроме
того, данный метод применяется для решения некоторых специальных задач:
мутагенеза генома растения с помощью Т-ДНК в качестве встраивающегося
случайным образом мутагенного элемента либо для случайного встраивания
беспромоторных доминантных селективных маркерных генов с целью выделения
промоторов (см., на-лример, [8]).
Отметим следующие общие свойства малых гомогенных эксплантатов.
1. Доступно большое количество эксплантатов.
2. Популяции протопластов, клеток и клеточных агрегатов обычно
относительно гомогенны в отношении типа клеток и их. поведения в культуре
ткани по сравнению с клетками больших гетерогенных эксплантатов.
3. Во многих системах большинство клеток подвержены делениям и
значительная их часть доступна для контакта с агробактериями, а не
спрятана глубоко в ткани.
4. Можно поддерживать популяции, содержащие большое количество
протопластов, клеток и клеточных агрегатов, разводить в жидкой среде и
высевать на чашки или заплавлять в слой агара или агарозы в твердых
средах; все эти свойства способствуют селекции трансформантов.
5. Рост при низкой плотности клеток можно получить, используя фидерный
слой. Это означает, что на последующих этапах селекции "перекрестное
питание" или токсические эффекты будут сведены к минимуму и значительно
увеличивается вероятность эффективной селекции трансформированных
колоний.
6. Колонии, вырастающие из высаженных на чашку клеток, как правило, будут
клонально чистыми, и любые побеги, регенерированные из таких тканей, не
должны быть химерными.
2.6.2. Разработка систем совместного культивирования
Разработку методов трансформации культуры клеток, равно как и
трансформации больших гетерогенных эксплантатов, можно разбить на
следующие этапы:
1. Первый и, возможно, наиболее важный этап - это разработка условий
культивирования отдельных клеток и небольших клеточных агрегатов,
подходящих для экспериментов по трансформации. Важно подобрать среды и
условия культивирования, которые допускают низкие плотности высева (102-
142
Глава 2
103 клеток/мл) и поддерживают высокую "эффективность высева" (доля
высеянных на чашку клеток, приступивших к делению).
2. Анализируют рост высеянных клеток и определяют время вступления клеток
в митоз, чтобы добавить агробактерии именно в тот момент, когда
растительные клетки компетентны для трансформации. Это особенно важно для
протопластов, которым может потребоваться около недели или более для
дедифференциации, восстановления клеточной стенки, начала репликации
генома и инициации клеточного деления. Высев на чашку суспензионной
культуры с низкой плотностью клеток, как правило, тормозит деление до тех
пор, пока клетки не кондиционируют среду, что может занять несколько
дней. В большинстве случаев можно использовать фидерный слой, чтобы
облегчить рост протопластов или суспензионной культуры с низкой
плотностью клеток. Важно детально знать характеристики системы
культивирования. Кроме того, система'должна быть воспроизводимой, чтобы
время, в течение которого живые агробактерии культивируются с
растительными клетками, сократить до минимума; иначе бактерии заполняют
культуральную среду и вызывают гибель растительных клеток.
4. Оценивают генотип используемых агробактерий, системы шУ-помощников Ri-
или Ti-плазмид, плотность бактериальной суспензии, время совместного
культивирования и условия культивирования, обеспечивающие трансформацию,
но не ингибирующие рост растительных клеток.
5. Определяют минимальную концентрацию агента для селекции трансформантов
(например, канамицина), которая ингибирует рост свежевысеянных клеток,
микроколоний, больших колоний, каллуса и регенерируемых побегов.
6. После совместного культивирования определяют стадию развития колоний,
на которой можно применять селективное давление при соответствующей
концентрации селективного агента, определенной, как указано в п. 5.
Для многих видов сельскохозяйственных растений получение культур
быстрорастущих тонких суспензий клеток представляет некоторые трудности и
надежное выращивание протопластов почти исключено. В тех случаях, когда
удавалось разработать подходящую культуру клеток, часто оказывалось, что
эффективно регенерировать побеги невозможно. Кроме того, продолжительное
культивирование in vitro в недифференцированном состоянии может приводить
к необратимым изменениям кариоти-па или генотипа. Культивирование клеток
многих сельскохозяйственных растений обсуждается в литературе [25, 26,
70].
Трансформация клеток двудольных растений
