Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
Килнера и помещают на стерильную белую кафельную плитку. Не переносят
сразу слишком много проростков, поскольку они могут высохнуть.
3. С помощью стерильного пинцета и нового стерильного скальпеля из
каждого проростка нарезают сегменты гипокотилей длиной по 1-2 мм, как
показано на рис. 2.12. Гипокотили обычно легко узнать по зеленой окраске.
Режущие инструменты следует регулярно стерилизовать, смачивая их в
спирте, обжигая в пламени горелки и охлаждая перед тем, как
Трансформация клеток двудольных растений
137
разрезать эксплантаты. Нарезают по 40 сегментов гипокоти-ля для
каждой серии (стадия 1)-всего 80 эксплантатов гипокотиля.
4. Помещают сегменты гипокотиля (20 сегментов на чашку) на чашки,
приготовленные, как указано на стадии 1, и оставляют в ламинарном боксе
примерно на 2 ч6'.
5. Переносят с помощью стерильного пинцета инокулированные и
неинокулированные сегменты гипокотиля с каждой чашки на чашки со средой
MSD4X2 (агаризованной, всего 4 чашки) и обматывают края чашек липкой
лентой Nescofilm.
6. Инкубируют чашки при 24-26 °С с фотопериодом 16 ч (3000-4000 люкс) от
16 ч (в течение ночи) до 2 сут. Переносят на содержащую антибиотик среду,
как описано на стадии 7, прежде чем появятся колонии агробактерий.
7. С помощью стерильного скальпеля переносят все сегменты гипокотиля с
одной чашки каждой серии на 5 чашек со средой MSD4X2 + Cx, а сегменты
гипокотиля с другой чашки каждой серии на 5 чашек со средой MSD4X2+Cx+
Km.
8. Обматывают края чашек липкой лентой Nescofilm и инкубируют, как на
стадии 6. Периодически наблюдают за развитием побегов и каллуса(r)).
Регенерация побегов из трансформированного каллуса
1. Наблюдают за инокулированными (серия А) и контрольными (серия Б на
среде MSD4x2 + Cx) эксплантатами и определяют, происходит ли нормальное
образование каллуса и регенерация после обработки и без обработки
агробактериями. Аналогичным образом проверяют контрольные и
инокулированные эксплантаты на селективной среде (MSD4X2+ -ЬСх+Km) и
отмечают появление любого трансформированного каллуса или побегов.
Рис. 2.11, Г-Е иллюстрирует влияние цефотаксима и ка-намицина на
регенерацию побегов и образование каллуса после инокуляции гипокотилей
льна штаммом A. tumefaciens, несущим селективный маркерный ген Kmr. На
рис. 2.11, Г показан внешний вид эксплантатов гипокотиля льна через две
недели после инокуляции штаммом Agrobacterium С58С1 (pGV3850:: 1103) и
инкубации на среде для селекции трансформантов (MSD4x2 + Cx+ Km).
Обратите внимание на рост Ктг-каллуса на некоторых эксплантатах и на тот
факт,1 что регенерация побегов полностью ингибирована в присутствии
канамицина.
2. Осторожно срезают каллус с инокулированных эксплантатов, переносят на
свежую селективную среду (MSD4X2+Cx+ Km) и инкубируют при 24-26°С и 3000-
4000 люкс (с 16-часовым фотопериодом) в течение 2-6 нед. На рис.
138
Глава 2
2.11,Д показаны резистентные к канамицину каллусы, продолжающие расти
на селективной среде. Аналогичным образом переносят все каллусы,
образовавшиеся на неинокулиро-ванных проростках, на среду MSD4X2+Cx и
инкубируют, как описано выше.
3. Отмечают регенерацию побегов из Kmr- и контрольного каллусов. Как
показано на рис. 2А\,Е, регенерация побегов из недифференцированных
клеток - гораздо более редкое событие, чем формирование побегов из
первичных эксплантатов.
4. Важно иметь в виду, что у большинства видов каллус, формирующийся на
эксплантатах, помещенных на селективные среды, может лишь частично
состоять из трансформированных, резистентных к антибиотику клеток.- Таким
образом, критический момент - это достижение правильного соотношения
ткань:среда, чтобы обеспечить достаточное количество трансформированных
клеток. Последние быстро кондиционируют среду и обеспечивают собственный
рост, прежде чем токсические соединения (например, полифенолы),
выделяемые погибающими нетрансформированными клетками, накопятся в
летальных количествах.
Селекция, размножение и укоренение трансформированных побегов
Оценить трансформированный статус любых регенерированных Кшг-побегов
можно по их способности к росту в присутствии селективного агента. Однако
нетрансформированные организованные ткани, как правило, достаточно
устойчивы к тем концентрациям антибиотиков, которые в норме подавляют
рост каллуса. Таким образом, трансформированный фенотип должен быть
подтвержден при тестировании активности маркерного фермента (например,
NPT-II) и выявлении Т-ДНК, как описано в гл. 5 и 6. Однако, чтобы
получить достаточное количество материала, необходимо размножить побеги,
как описано в следующем разделе.
Следует отметить, что тестирование активности NPT-II ' и блоттннг-
гибридизация по Саузерну в случае Кшг-каллусов льна и регенерированных
Кшг-побегов обеспечивает строгое доказательство того, что в описанных
выше условиях вырастающий на гипокотилях льна Ктг-каллус представляет
собой результат одного или очень небольшого числа первичных событий
