Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
трансформации и, видимо, целиком состоит из клональных потомков
первоначально трансформированных клеток [10].
Кроме того, следует обратить внимание на то обстоятельство, что
зародыши побегов, образующиеся на недифференциро-
Трансформация клеток двудольных растений
139
ванных каллусах, предположительно развиваются из отдельной
"активированной" клетки, реагирующей на воздействие среды. Таким образом,
при регенерации побегов из гетерогенного (в отношении типа клеток)
каллуса на селективной среде эффективно образуются трансформированные
клоны. До сих пор не существует доказательств, что из гетерогенной смеси
трансформированных и нетрансформированных клеток развиваются химерные
побеги.
1. Берут кусочки каллуса с неинокулированных эксплантатов на среде MSD4X2
+ Cx и инокулированных эксплантатов на селективной среде (MSD4X2-I-Сх +
Km) и помещают их в чашку Петри.
2. Не захватывая каллус, срезают у основания достаточно большие побеги
(>0,5 см), чтобы с ними было легко обращаться. Старайтесь не повредить
верхушку!
3. Удаляют все листья у основания побега и быстро помещают 3-4 побега
основанием вниз в среду MSFLAX+ Cx-f Km.
4. Закручивают крышку сосуда Powder Round, не затягивая полностью, и
обматывают края лентой Nescofilm. Инкубируют при 24-27 °С при умеренной
освещенности (4000 люкс) с 16-часовым фотопериодом.
5. Отмечают рост как трансформированных, так и нетрансформированных
побегов в течение нескольких последующих недель. Побеги с инокулированных
эксплантатов продолжают развиваться, тогда как рост нетрансформированных
побегов в течение нескольких дней угнетается и побеги обесцвечиваются.
6. Трансформированные побеги, удлинившиеся на среде MS FLAX-f-Cx+Km,
можно размножить вегетативно, срезая секции междоузлий и помещая их
обратно на ту же самую средуг>. Пазушные побеги должны развиться из
пазушных почек на срезах междоузлий в течение 1-2 нед. Селекция и
размножение побегов до переноса на среду для укоренения устраняет две
проблемы:
а) Необходимость получения укоренившихся трансформированных побегов
(которые очень трудно получить в случае льна) для вегетативного
размножения.
б) Использование цефотаксима на стадии укоренения, поскольку любые
агробактерии, которые еще растут на регенерированных побегах, будут
уничтожены уже во время стадии селекции и размножения.
7. Укореняют побеги, отобранные и размноженные на MS FLAX+Cx + Km, путем
переноса здоровых пазушных побегов на среду для укоренения льна (0,5-
кратная В5+Кт)д>. Отмечают развитие корневой системы в течение
последующих 2-3 нед.
140
Глава 2
8. Переносят побеги в стерильный вермикулит, смоченный раствором
Хогланда, сразу же после появления заметного корняеК
*9. Укоренившиеся побеги адаптируют в смеси компост/вермикулит, как
описано в разд. 2.4.3. Следует строго соблюдать все предосторожности,
предусмотренные этой методикой.
Примечания
*) Заполняют 1/3 сосуда Килнера вермикулитом и смачивают 100-200 мл
раствора Хогланда. Стерилизуют автоклавированием.
(r)> См. примечание д а разд. 2.2.3.
в) Иногда необходимо перенести сегменты гипокотиля на свежую среду,
содержащую антибиотики (например, цефотаксим), и продолжить
культивирование на этой среде, чтобы подавить рост появляющихся
агробактерий.
г> Методика вегетативного размножения из срезов междоузлий аналогична
описанной для табака в разд. 2.4.3. Часто у основания среза междоузлия
индуцируется каллус, который может регенерировать побеги через несколько
недель, если побег не субкультивируется. Иногда индуцируются корни, и в
этом случае побеги можно непосредственно переносить в стерильный
вермикулит, а затем в смесь компост/вермикулит без переноса на среду для
укоренения.
д) Важно быть уверенным, что срезаемые пазушные побеги свободны от
агробактерий, поскольку среда для укоренения не содержит бактериоста-
тических антибиотиков. Антибиотики полностью ингибируют или замедляют
корнеобразование у многих видов.
Верхушка побега часто вянет и гибнет на среде для укоренения даже
после того, как образовались корни. Однако отсутствие апикального
доминирования приводит к росту новых сильных побегов, развивающихся из
расположенных ниже пазушных почек. Эти побеги можно срезать для индукции
корней или использовать для размножения растения.
е) Данный этап гарантирует дальнейшее развитие корня и рост побега в
отсутствие твердой среды, содержащей гормоны и источник углерода. Это
помогает адаптировать побеги к фотоавтотрофному росту и позволяет им
быстро приживаться после переноса в смесь компост/вермикулит в теплице.
2.6. Трансформация малых гомогенных эксплантатов
2.&.1. Основные положения
Малые гомогенные эксплантаты могут быть представлены как отдельными
клетками или протопластами, так и встречающимися в суспензионных
культурах небольшими клеточными агрегатами, образованными различным
числом клеток. Популяции таких эксплантатов можно использовать в
экспериментах по трансформации, а для манипуляций с ними применять
