Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
Примечания
*> Методы размножения известны и для многих других видов [24* 25, 26,
70].
MSK представляет собой типичную среду для размножения и содержит
небольшое количество цитокнннна кннетнна, который способствует сохранению
жизнеспособности эксплантата и стимулирует развитие пазушных побегов из
предшествующих покоящихся пазушных меристем. Без добавления цнтокннннов
будет развиваться только один, апикально доминирующий побег, уменьшая,
таким образом, скорость размножения. Следует отметить, что этн побеги не
являются адвентивными н в большинстве случаев представляют собой
генетические клоны первоначально трансформированного побега.
*> Целесообразно включить в среду для размножения бактериостатнческий
антибиотик, чтобы элиминировать любые оставшиеся агробактерин.
Повторное укоренение культивируемых растений в компосте
и выращивание их до зрелого состояния
1. Осторожно удаляют укорененные побеги высотой 3-5 см из среды, стараясь
не повредить верхушку. .
2. Быстро смывают с корней агар и помещают растеньице в отверстие
соответствующего размера в заполненном компостом маленьком цветочном
горшкеа). Засыпают корни компостом и осторожно уплотняют компост,
одновременно аккуратно поддерживая растеньице.
3. Чтобы избежать засыхания, как можно быстрее помещают высаженные
растеньица во влажную среду, например в маленький обычный инкубатор,
увлажняемую нишу в теплице или пластиковый мешокб).
4. Выращивают растение при умеренной освещенности (15 000 люкс), пока оно
не "закалится", а затем переносят из влажной камеры(r)) в закрытую теплицу
или комнатуг>.
5. Закрывают мешками распустившиеся цветы, чтобы избежать перекрестного
опыления и попадания трансформированной пыльцы в окружающую средуд>.
6. Собирают семена, когда они высохнут (или на соответствующей стадии), и
хранят в запечатанных пакетах для семян в прохладном, сухом и закрытом
помещении.
130
Глава 2
Примечания
а> Когда растения впервые перенесены в компост, целесообразно удалить
некоторые из нижних листьев (которые, вероятно, все равно сгниют!) и
прикопать стебель на пару сантиметров. Это помогает побегам сохранить
прямостоячее положение и укрепляет растение.
в) Старайтесь, чтобы листья и верхушка не прикасались к компосту и
сосуду, поскольку они могут прилипнуть к ним, когда растение начнет
увядать перед тем, как разовьются корни. Это может повредить растение и
повышает его восприимчивость к поражению грибами.
Е> Для многих видов рекомендуется постепенное закаливание, поскольку
резкий переход от культиватора с высокой влажностью к относительно сухой
атмосфере теплицы может оказаться для растения губительным. Стандартный
метод заключается в том, что влажность постепенно уменьшают, проделывая
отдушины в контейнере для роста.
г) Во многих случаях растения, полученные из культуры ткани, проявляют
ряд морфологических аномалий, включая уменьшенный размер и атипичную
форму листа, измененную длину междоузлий и пониженное число цветков
(иногда растения отличаются и пониженной фертильностью). Эти аномалии
обычно носят эпигенетический характер и обусловлены тем, что растение
регенерировало из культуры, а также стрессом, связанным с повторным
укоренением в компосте и переключением на фо-тоавтотрофный рост.
Следовательно, прежде чем сделать какие-либо заключения, анализируют
морфологию Fi-проростков, размноженных нормальным образом.
д> Важно изолировать все трансформированные растения от других
трансформированных и нетрансформированных растений, которых они могут
перекрестно опылять. Если эта предосторожность не соблюдается, то не
только трансформированная пыльца может попасть в окружающую среду, но и
(особенно у перекрестно опыляемых растений) опыление индивидуально
трансформированного растения пыльцой другого или пыльцой" растения дикого
типа может исказить результаты любых исследований по экспрессии и
сегрегации перенесенных генов в Fi и последующих поколениях.
2.5. Регенерация трансформированных растений через стадию каллуса:
трансформация эксплантатов проростков льна
2.5.1. Основные положения
Одна из важнейших задач при разработке методики генетической
трансформации любых видов растений заключается в идентификации подходящих
эксплантатов, из которых может произойти эффективная регенерация побегов.
Обычный подход-это определить эксплантат и комбинации сред, которые
стимулируют регенерацию растения путем органо- или эмбриогенеза.
Невозможно предсказать условия, приводящие к регенерации побегов у
каждого вида, поэтому изложенная ниже методика дает только общие принципы
поиска. Как правило, если литература по культивированию какого-либо
отдельного вида отсутствует, можно попытаться осуществить регенерацшо
Трансформация клеток двудольных растений
131
лутем случайного подбора сред, успешно используемых для других видов. Не
существует твердых и простых правил составления оптимальной среды для
регенерации, и состав среды можно определить только эмпирическим путем.
