Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 57

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 51 52 53 54 55 56 < 57 > 58 59 60 61 62 63 .. 184 >> Следующая

обработки, и перенесение их на селективную среду для укоренения и
выявления трансформированных побегов. Если эксперимент по трансформации
данного сорта проводится впервые, то прежде, чем переносить побеги, важно
сделать некоторые наблюдения, помогающие спланировать дальнейшие
эксперименты с помощью метода листовых дисков.
Итак, определяют участки образования каллуса и регенерации побегов
(используют препаровальную лупу). Определяют число и размер побегов,
получаемых при каждой обработке, и оценивают:
1. Нормальную способность листовых дисков формировать каллус и
регенерировать побеги (рис. 2.8, Л).
2. Влияние бактериостатического агента (в данном случае, це-фотаксима) на
образование каллуса и регенерацию побегов.
124
Глава 2
Рис. 2.8. Трансформация листовых дисков табака. Внешний вид листовых
дисков через 5-6 нед инкубации на различных средах. А. Неинокулированные
диски на среде для регенерации побегов, MSD4X2. Б. Неинокулированные
диски на MSD4X2+200 Сх. В. Диски на MSD4X2+100Km. Г. Диски,
инокулированные штаммом A. tumefaciens С58С1 (pGV3850) и помещенные на
чашку с MSD4X2+200 Сх. Д Диски, инокулированные штаммом A. tumefaciens
С58С1 (pGV3850:: 1103) и помещенные на чашку с MSD4X2+200 Сх. Е. Диски,
инокулированные штаммом A. tumefaciens С58С1 (pGV3850), на чашке со
средой MSD4x2+200 Сх+100 Km. Ж. Диски, инокулированные штаммом A.
tumefaciens С58С1 (pGV3850: : 1103), на среде MSD4X2+200 Сх+100 Km.
Трансформация клеток двудольных растений
125
Так; сравнивают регенерацию на средах MSD4X2 (рис.
2.8, Л) и MSD4X2-J-Cx (рис. 2.8, Б).
3. Влияние агробактерий на образование каллуса и регенерацию побегов.
Так, сравнивают ответ инокулированнЫх (рис.
2.8, Г, Д) и неинокулированных листовых дисков (рис. 2.8, Б) на
MSD4X2-J-Cx.
4. Действие агента для селекции трансформантов (в данном случае
канамицина) на образование каллуса и регенерацию побегов. Сравнивают
ответ неинокулированных контролен на MSD4X2 (рис. 2.8, Л) и MSD4X2-J-Km
(рис. 2.8, В).
5. Влияние переноса гена Ктг на образование каллуса и побегов в
присутствии канамицина. Так, сравнивают листовые диски на MSD4X2+Cx+Km,
инокулированные С58С1 (pGV3850) (рис. 2.8, Е), с листовыми дисками на той
жг среде, инокулированными С58С1 (pGV3850 :: 1103) (рис. 2.8,Ж).
Примечания
s) 10%-ный Domestos содержит около 1% активного хлора и эквивалентен 1%-
ному раствору гипохлорита кальция илн натрня. Domesto^ содержит
смачивающий агент, который способствует процессу стерилизации.
Концентрацию стерилизующего вещества и время инкубации следует подобрать
заранее, чтобы достигнуть эффективной стерилизации, не вызывая
значительных повреждений ткани.
(r)) MSD4X2 предназначена для стимулирования регенерации побегов и"
эксплантатов листа.
в) Длительное смачивание некоторых типов листьев может оказать
нежелательное влияние на результат эксперимента, и его следует избегать.
У таких видов, как картофель, целесообразно вызвать образование каллуса
на краях среза эксплантата за несколько дней до обработки агробакте-
рнями.
г) В некоторых случаях полезнее инкубировать ннокулируемые кусочки листа
на "подпитывающем" (фидерном) слое (разд. 2.10.2.2), не содержащем
антибиотиков, чтобы стимулировать деление растительных клеток вблизи
срезанных краев и способствовать трансформации [40].
Для эксплантатов других видов растений может оказаться полезной
стимуляция образования каллуса (с селекцией или без селекции на Km) у
края среза ткани путем подращивания в течение нескольких дней на среде
для каллусообразования (например, MSP1 для табака, приложение 2[II]), до
переноса на среду для регенерации побегов.
е) Время инкубации должно быть достаточно продолжительным, чтобы
позволить агробактериям трансформировать растительные клетки, но нельзя
допускать, чтобы кусочки листа зарастали бактериями н происходила гибель
клеток.
*> Кусочки листа часто разбухают, закручиваются, и в результате края
среза теряют контакт со средой. Поэтому рекомендуется надрезать
эксплантат и прижать края среза листовых дисков к питательной среде.
Укоренение трансформированных побегов
Как правило, дифференцированные структуры, например побеги, менее
чувствительны к селективным агентам (например.
канамицину), чем каллус. Таким образом, в зависимости от
126
Глава 2
концентрации антибиотика ^трансформированные побеги иногда выживают в
процессе селекции [40, 49J; это явление часто рассматривают как "пробой"
("escapes"). Однако корни, как правило, в большей степени чувствительны к
антибиотикам, и, следовательно, способность побегов укореняться на
селективной среде, содержащей более высокие концентрации селективного
агента (например, канамицина), представляет собой весомое доказательство
их трансформированной природы3'.
1. Берут регенерирующие кусочки листа, полученные при инокуляциях С58С1
(pGV3850 :: 1103) или LBA4404(pBinl9), со среды MSD4X24-Cx-J-Km и
помещают в чашку Петри.
2. Срезают достаточно большие побеги, чтобы с ними было легко
Предыдущая << 1 .. 51 52 53 54 55 56 < 57 > 58 59 60 61 62 63 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed