Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 58

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 52 53 54 55 56 57 < 58 > 59 60 61 62 63 64 .. 184 >> Следующая

манипулировать (>0,5 см), и полностью удаляют каллус.
3. Подрезают нижнюю часть побега, пока не останется верхушечная почка и
два или три листа с пазушными почками. Не пытайтесь укоренять
веретенообразные (длинные и тонкие) или слишком сильно этиолированные
побеги, поскольку в дальнейшем они трудно приживаются в почве. Избегайте
подсыхания побегов и сразу же переносите их на среду для ускоренения.
4. Помещают срезанные побеги основанием вниз в агар со средами MSO-J-
Cx6)'в) (приложение 2[П]) и MSO+Cx+Km и инкубируют при 24-28 °С и средней
освещенности (4000 люкс). Контрольный опыт на среде, не содержащей
селективного агента, необходим, чтобы удостовериться в том, что
укоренение происходит нормально.
5. Повторяют стадии 1-4 с побегами, регенерированными из кусочков листа
на среде MSD4X2-J-Cx, которые были иноку-лированы неонкогенными
вектора1Ми без селективных маркерных генов [например, LBA4404 или С58С1
(pGV3850)], чтобы убедиться в надежности процедуры селекции.
6. В последующие 5-20 дней периодически наблюдают за эксплантатами
побегов, следя за появлением признаков образования корней, хлороза и
формирования новых листьев. Некоторые нетрансформированные побеги часто
успевают пускать новые побеги прежде, чем становятся хлоротическими, а
впоследствии погибают только через несколько недель культивирования на
среде, содержащей селективный агент (например, канамицин). Однако в
большинстве случаев только трансформированные побеги успешно укореняются
на среде, содержащей канамицин. Следует еще раз отметить, что часть
побегов, полученных из листовых дисков, нередко укореняется в присутствии
селективного агента; такие "неудачи" в порядке вещей.
Трансформация клеток двудольных растений
127
Примечания
а) Для многих видов более эффективной может оказаться регенерация
побегов на неселективных средах, а селективное давление следует применять
на стаднн укоренения.
6> Чтобы свести к минимуму образование каллуса, среды, используемые для
укоренения регенерированных побегов, обычно не содержат фнто* гормонов
либо содержат небольшое количество "слабого" ауксина, например ИУК.
Обычно в этих условиях укоренение возможно, поскольку верхушка побега
продуцирует ИУК, который транспортируется вниз по стеблю и индуцирует
рост корней у основания. В некоторых случаях желательно дать побегу
прижиться на среде для укоренения без канами-цина, позволяя ему
образовать несколько новых листьев, прежде чем снова отрезать корни и
попытаться укоренить на среде, содержащей канамицин.
в) Бактериостатические антибиотики часто вводят в среду, если какие-либо
агробактерии выжили при предшествующей обработке. Однако это дорого;
кроме того, антибиотики иногда тормозят рост побегов и формирование
корней.
Поддержание и размножение трансформированных побегов
Для размножения культивируемых побегов многих видов растений известны
два основных способа. Побеги можно высадить в компост, выращивать их
фотоавтотрофно и размножать путем получения семян. Это, разумеется,
необходимо для изучения нормальной экспрессии и наследования
перенесенного гена. Однако может оказаться, что после длительной тяжелой
работы регенерировано всего несколько трансформированных побегов. В этих
случаях целесообразнее размножить этот чрезвычайно ценный материал
вегетативно. Такая необходимость возникает потому, что многие
гетеротрофные побеги не приживаются в почве как фотоавтотрофные растения
(культивируемые побеги не способны к интенсивному фотосинтезу, а зависят
от питательных веществ, содержащихся в ростовой среде). До тех пор пока
растения не "закалятся" (сформируют восковую кутикулу), многие из них
будут увядать и никогда не восстановятся. Кроме того, в этих условиях
растения очень восприимчивы к поражению грибами. Возможна и атака
вредителей или патогенов прежде, чем завяжутся семена, так что разумно
сохранять линии растений в культуре. Для примера в следующем разделе
описано размножение побегов табака.
Размножение табака с помощью пазушных почека>
1. Удаляют укорененные побеги со среды и помещают на стерильную белую
кафельную плитку.
2. Разрезают стебель на несколько частей, каждая из которых содержит
пазушную почку, как изображено на рис. 2.9. Удаляют листья, оставив
только короткие (2-3 мм) отрезки черешков.
128
Глава 2
Рис. 2.9. Размножение растений в стерильных условиях путем развития
пазушных почек.
Трансформация клеток двудольных растений
129
3. Помещают 4-6 участков стебля основанием вниз в среду MSK6),B)
(приложение 2[П]) так, чтобы пазуха находилась как раз на уровне
поверхности среды.
4. Инкубируют при 24-26 °С и умеренной освещенности (3000- 4000 люкс).
Через 2-3 нед из пазухи листа должен развиться один или более побегов.
Пазушные побеги можно размножать дальше либо укоренить, как описано выше.
Побеги переносят на свежую среду через 1-2 мес или в тот момент, когда
растения достигнут верха сосуда, в котором они находятся.
Предыдущая << 1 .. 52 53 54 55 56 57 < 58 > 59 60 61 62 63 64 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed